山药块茎膨大期淀粉积累及淀粉合成相关基因表达分析

摘    要：为探讨山药块茎膨大期淀粉的积累机制，以大和长芋山药为试验材料，测定了块茎膨大期各类淀粉含量、淀粉合成关键酶活性以及淀粉合成相关基因的表达水平。结果表明，山药块茎膨大期总淀粉、直链淀粉及支链淀粉的积累呈先增加后降低的趋势，种植后150 d支链淀粉占总淀粉含量的88.35%，总淀粉含量的增加主要是支链淀粉的积累；ADP-葡萄糖焦磷酸化酶（AGPase）、淀粉分支酶（SBE）与支链淀粉的积累呈极显著正相关，是直接参与支链淀粉积累的重要功能酶。AGPase、SSⅡ、SSⅢ、SBEⅡ基因的表达量与支链淀粉含量呈极显著正相关，是支链淀粉积累的关键因素。SBE对淀粉积累表现为直接正效应，AGPase和束缚态淀粉合成酶（GBSS）在直链淀粉积累中体现为直接正效应。这些研究对揭示山药块茎淀粉合成的分子机制具有重要意义。

关键词：山药块茎；淀粉积累；淀粉合成关键酶；基因表达

中图分类号：S632.1 文献标志码：A 文章编号：1673-2871（2023）03-069-08

Analysis of starch accumulation and starch synthesis-related gene expression during tuber expansion stage of yam

SUO Ningning， ZHANG Yanfang， GAO Yuanli， ZHAO Lingmin， GE Mingran， LIU Jiecai， HUO Xiuwen

（College of Horticulture and Plant Protection， Inner Mongolia Agricultural University， Hohhot 010019， Inner Mongolia， China）

Abstract： In order to explore the accumulation mechanism of starch during the expansion stage in yam tubers， we investigated the changes in starch content of various types， activity of key enzymes in starch synthesis and gene expression patterns of starch synthesis key enzymes in Dahechangyu yam tubers. The results showed that the accumulation of total starch， amylose and amylopectin showed a trend of increasing first and then decreasing during tuber expansion stage of yam， and amylopectin accounts for 88.35% of the total starch content 150 days after planting. The increase of total starch content mainly results from amylopectin accumulation. Glucose-1-phosphate adenylyltransferase（AGPase）and starch-branching enzyme（SBE）have significant positive correlation with the accumulation of amylopectin， and are important functional enzymes directly involved in the accumulation of amylopectin. The gene expression level of AGPase， SSII， SSIII， SBEII was positively correlated with amylopectin content， which was the key factor of amylopectin accumulation in yam tubers. SBE showed a directly positive effect on starch accumulation， AGPase and granule bound starch synthase have directly positive effect on amylose accumulation. These studies are of great significance to reveal the molecular mechanism of starch synthesis in yam tubers.

Key words： Yam tuber; Starch accumulation; Starch synthesis key enzyme; Gene expression

山药（Dioscorea opposita Thunb.）是薯蓣科（Dioscoreaceae）薯蓣属（Dioscorea L．）一年生或多年生缠绕性草质藤本，为单子叶植物[1]。山药块茎中含有丰富的淀粉（70%）、蛋白质（9%）、还富含矿物质、尿囊素、皂苷等活性物质，并且与其他作物如马铃薯、木薯和甘薯相比，山药有着更好的感官特性，因此，近年来对山药的需求量逐年增多[2]。

淀粉是山药块茎中最丰富的碳水化合物，含量约占块茎干质量的80%左右。淀粉积累不仅影响块茎膨大，对山药直接经济效益的产生和品质形成也具有重要作用。前人通过对马铃薯块茎的研究发现，叶片光合作用产生的同化物以蔗糖的形式通过韧皮部输送到块茎内，然后经由ADP-葡萄糖焦磷酸化酶（glucose-1-phosphate adenylyltransferase，AGPase）、可溶性淀粉合成酶（starch synthase，SSS）、束缚态淀粉合成酶（granule bound starch synthase，GBSS）、淀粉分支酶（starch-branching enzyme，SBE）等淀粉合成关键酶的协同作用催化淀粉的合成[3]。AGPase催化形成淀粉合成的底物ADPG，是途径中的关键酶和限速酶。据前人报道，利用Patatin启动子驱动马铃薯AGPase表达，转基因马铃薯的淀粉含量较野生型提高了35%[4]。利用基因沉默抑制AGPase表达，马铃薯淀粉含量比对照低4%～35%[5]。马铃薯块茎中AGPase的下调会引起GBSSI的表达[6]。GBSS主要负责直链淀粉的合成，还未有其他合酶可以取代该功能。Kitahara等[7]利用RNAi技术抑制GBSSI表达，发现GBSS不仅有助于直链淀粉的积累，而且还参与支链淀粉长链的合成。根据氨基酸序列的相似性，SSS被分成多种异构体，在块茎作物中主要是指SSⅡ和SSⅢ，其在支链淀粉的合成中起重要作用[8-9]。拟南芥SSⅡ的缺失不会影响叶片生长速度和淀粉的含量，但抑制了中等长度支链淀粉的合成，这在马铃薯块茎的研究中也得到了类似的结果[10-11]。SSⅢ的过表达会使细胞中产生大量的小淀粉粒，中心位置通常有裂纹[10]。SBE主要包含两类同工酶SBEⅠ和SBEⅡ；主要影响支链淀粉的分支[12]。抑制SBEⅡ的表达，马铃薯淀粉粒结构发生改变，支链淀粉和直链淀粉的含量增加；抑制SBEⅠ的表达对直链淀粉含量的影响不显著；而同时下调SBEⅠ和SBEⅡ，马铃薯中直链淀粉含量增加75%[13-14]。异淀粉酶、普鲁兰酶（pullulanase，PUL）及蔗糖合成酶（sucrose synthase，SUS）也参与了淀粉合成。增强转基因马铃薯中SUS的活性，块茎的淀粉含量和产量也得到提高[15]。此外，一些代谢物如3-磷酸甘油酸、焦磷酸盐等可以激活或抑制淀粉合成相关酶的活性进而影响淀粉积累[16]。近年来，基于山药块茎的生长分析、营养成分分析、细胞学特征分析或分子水平评价等对山药的淀粉积累特性和淀粉代谢调控方面的研究逐渐变多[17-19]。然而，迄今关于山药块茎淀粉合成关键酶与其编码基因表达量的综合性分析却鲜有研究，诸多未知点有待进一步挖掘。

为此，笔者以田间条件下内蒙古主栽山药品种大和长芋为试验材料，研究块茎膨大期淀粉的积累及相关淀粉合成关键酶的基因表达和活性变化；分析淀粉积累与相关淀粉合成关键酶活性和基因表达的相关性；通过通径分析进一步探索其对各类淀粉积累的影响。这不仅有助于揭示山药块茎淀粉合成的分子机制，而且对旨在获得高淀粉含量、高品质性状的山药育种目标具有实践指导意义。

1 材料与方法

1.1 材料

山药品种为大和长芋山药（Dioscorea opposita ‘Dahechangyu’），为笔者所在课题组上一年收获的自留种，于2021年5月初至10月末种植在内蒙古农业大学山药种质资源圃。试验选取15 cm左右晾晒好的的山药栽子播种，采用搭架栽培、双行种植的方式，行距60 cm，株距20 cm，于5月7日人工种植，常规田间管理。

1.2 方法

内蒙古地区大和长芋山药约在种植后75 d块茎开始膨大，165 d截止。试验于种植后的90、105、120、135、150、165 d取样，每个时期设置3次生物学重复，每次重复随机挖取3株长势一致的山药进行地下块茎采样。去除残留土壤后，从块茎中部称取2 g，3株等量混样，用锡纸包裹并标记，液氮速冻，-80 ℃冻存。

1.3 项目测定

1.3.1 山药块茎形态指标的测定 用游标卡尺和软尺测量清洗干净后块茎的直径和长度，电子秤称取块茎质量。

1.3.2 淀粉含量的测定 参照崔晋[20]等利用双波长法测定块茎淀粉含量。支链淀粉含量测定以538 nm为测定波长，758 nm为参比波长；直链淀粉含量测定以624 nm为测定波长，410 nm为参比波长。总淀粉含量/%=直链淀粉含量（%）+支链淀粉含量（%）。

1.3.3 淀粉形成关键酶活性的测定 称取约1.0 g左右的块茎，在预冷的研钵中磨成粉末，加入5 mL提取液［含100 mmol·L-1 pH 7.5的HEPES-NaOH，2 mmol·L-1 EDTA，8 mmol·L-1 MgCl2，12.5%甘油；50 mmol·L-1 β-巯基乙醇，1% PVP-40］，再次研磨后，在4 ℃ 10 000 r·min-1离心15 min，上清液作为测定AGPase、SSS和SBE活性的粗酶液。沉淀中再次加入5 mL提取液，振荡悬浮均匀后作为测定GBSS活性的粗酶液。参考程方民等[21]的方法测定AGPase、SSS和GBSS活性。SBE活性测定参照李太贵等[22]和赵法茂等[23]的方法。

1.3.4 淀粉形成关键酶的基因表达量 从-80 ℃冻存的块茎样品中提取总RNA。吸取2 μg提取出的总RNA利用反转录试剂盒（PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit）合成单链cDNA。从笔者课题组前期山药转录组测序结果中获得AGPase、SSII、SSIII、GBSSI、SBEI、SBEII的基因序列，使用Primer Premier 5.0软件设计用于实时荧光定量PCR（quantitative reverse transcription polymerase chain reaction，qRT-PCR）的引物（表1）。以合成的cDNA为模板，山药的18S为内参基因，利用Tag SYBR®Green qPCR Kit（Bio-Rad）试剂盒进行qRT-PCR。扩增反应结束后，绘制熔解曲线以确保引物的特异性。每个基因分析设置3次重复，2−ΔΔCT法计算基因的相对表达量。

1.4 数据分析

采用Microsoft Excel 2021进行试验数据分析及制图，采用SPSS v27.0软件进行方差分析、相关性分析及通径分析。

2 结果与分析

2.1 山药块茎形态指标的变化

由图1可知，整体来看，块茎质量、直径和长度的生长曲线呈“S”形变化。随着块茎的膨大，其质量、长度和直径不断增加，种植后90～150 d是其快速增长期，完成整个膨大期质量、长度和直径增长的80%左右，150 d后其生长速度放缓，进入平台期。

2.2 山药块茎中淀粉含量的变化

由图2-A可知，块茎总淀粉含量随时间推进呈升高趋势，且90、105、120 d间差异显著，这段时期淀粉积累迅速，而135 d以后淀粉积累基本进入平台期。直链淀粉在整个膨大期含量较低，最高时（135 d）约占总淀粉含量的10%（图2-B）。支链淀粉含量变化的总体趋势与总淀粉含量相似，种植后135～165 d差异不显著（图2-C）。山药种植后90 d淀粉直/支比为0.253，而150 d时直/支比减少为0.132（图2-D）；150 d时，支链淀粉的积累达到峰值，占总淀粉含量的88.35%。因此，山药块茎总淀粉含量的增加主要是由于支链淀粉的积累。

2.3 山药块茎中淀粉形成关键酶活性的变化

随着种植时间的推移，山药块茎中淀粉形成关键酶AGPase、SSS、GBSS和SBE活性变化基本一致，均在90～135 d酶活性提高，并且都在135 d时达到峰值，135～165 d又显著降低（图3）。

2.4 山药块茎中淀粉合成关键酶的基因表达量

为进一步了解块茎中淀粉合成关键酶相关基因的表达及其在块茎发育中的作用，采用qRT-PCR对6个基因的转录水平进行了研究。AGPase的表达量在135 d之前显著增加，然后在150 d后显著下降到120 d前的水平（图4-A）。SSⅡ在块茎中的表达量基本稳定，135 d时有显著高表达（图4-B）。SSⅢ在90～105 d的表达量较低，且无显著差异；120 d后SSⅢ的表达量显著升高，135 d达到最大值后又显著降低（图4-C）。GBSSⅠ在块茎中的表达量呈“升-降-升-降”波浪变化趋势，且在105 d的表达量显著高于其他时期（图4-D）。SBEⅠ基因从105 d显著升高后一直保持在恒定的高表达量水平，然后在165 d显著降低（图4-E）。SBEⅡ与SSⅡ的表达模式相似，在整个膨大期保持恒定的高表达量水平（图4-F）。