薹用白菜品种细胞质雄性不育类型的分子鉴定

摘    要：细胞质雄性不育（CMS）在薹用白菜育种中已被广泛使用，为提高其CMS类型鉴定的准确性和效率，探究当前薹用白菜育种中CMS类型的应用特征，首先针对已报道在薹用白菜中应用的Polima，Ogura与Hau类型的CMS开发了特异性多重PCR分子标记Brcms_M。该标记解决了现有Polima分子标记在Hau CMS材料中的假阳性问题，可同时将3种CMS类型与正常胞质类型区分开。利用Brcms_M对28个薹用白菜细胞质雄性不育杂交品种/组合进行鉴定，结果表明Polima是当前红菜薹育种中主要应用的CMS类型，白菜薹与菜心CMS则均以Ogura类型为主，同时发现2个存在不完全败育现象且不含恢复基因Rfo的Ogura CMS品种。

关键词：薹用白菜；雄性不育；多重PCR；分子标记

中图分类号：S634.5 文献标志码：A 文章编号：1673-2871（2023）12-039-08

Molecular identification of the cytoplasmic male sterile types in flowering Chinese cabbage

REN Zhiyong1， NIE Qijun1， DONG Binfeng1， HU Zhiwei1， ZHANG Junhong2， WANG Kun3，LI Jinquan1

（1. Key Laboratory of Vegetable Ecological Cultivation on Highland， Ministry of Agriculture and Rural Affairs/ Hubei Key Laboratory of Vegetable Germplasm Enhancement and Genetic Improvement/Institute of Economic Crops， Hubei Academy of Agricultural Sciences， Wuhan 430064， Hubei， China; 2. College of Horticulture and Forestry， Huazhong Agricultural University， Wuhan 430070， Hubei， China; 3. College of Life Science， Wuhan University， Wuhan 430072， Hubei， China）

Abstract： Cytoplasmic male sterility（CMS）has been widely applied in flowering Chinese cabbage breeding. To improve the accuracy and efficiency of CMS type identification and investigate the CMS application in flowering Chinese cabbage， the specific multiplex PCR CMS marker Brcms_M for simultaneously detecting Polima， Ogura and Hau CMS was developed. Brcms_M could overcome the false positive problem in Polima CMS identification when using the reported Polima markers in Hau CMS materials， and also could distinguish three CMS and normal cytoplasmic type. Brcms_M was furtherly used to identify the CMS type of the twenty-eight flowering Chinese cabbage varieties. The result of CMS type identification indicated that Polima CMS was the mainly applied in purple flowering Chinese cabbage breeding， and CMS type of white flowering Chinese cabbage and flowering Chinese cabbage majorly belong to the Ogura CMS. Interestingly， two partial sterility varieties were also identified as Ogura CMS type， Ogura CMS restorer gene Rfo was not found in these two varieties.

Key words： Flowering Chinese cabbage; CMS; Multiplex PCR; Molecular marker

薹用白菜由十字花科芸薹种中以花薹为食用器官的变种或亚种组成，主要包括红菜薹（Brassica rapa ssp. chinensis var. purpurea）、菜心（B. rapa ssp. parachinensis）以及白菜薹[1]。红菜薹是起源于长江流域的不结球白菜变种，茎叶呈紫红色，食用品质极佳，是湖北、湖南及四川等长江流域省份秋冬季节栽培的重要特色蔬菜[2]。菜心则起源于我国的华南地区，生长周期短，规模化种植基地遍布全国各地，可实现周年生产，已成为新兴的大宗叶菜类蔬菜[3]。白菜薹主要在我国南方地区的秋冬季节种植[4]，构成较为复杂，最早期的白菜薹是农民在长期种植过程中选择出来的一类具有早抽薹特性的弱冬性不结球白菜（B. rapa ssp. chinensis）品种，育种家则通过将不结球白菜与不需低温春化即可抽薹的菜心杂交，再进一步通过系统的自交选择获得的能够在年前抽薹的常规品种[5]。而当前市场上流行的白菜薹杂交品种则主要由不结球白菜与菜心杂交配组产生[6-7]。薹用白菜主要由幼嫩花薹为食用器官，不同类型又有所区别，其中红菜薹主要食用花蕾、薹茎，薹叶食用较少，菜心与白菜薹则三者均可食用。

与其他十字花科蔬菜一样，早期的薹用白菜杂交品种选育主要利用自交不亲和技术，然而自交不亲和技术生产杂交种成本较高，需要通过人工剥蕾繁殖制种亲本，杂交种纯度也受亲本自交不亲和性强弱的影响[8]。对于十字花科蔬菜而言，食用器官不是种子，利用细胞质雄性不育（CMS）选育杂交种时无需将父本改造为恢复系，只需创制出母本的不育系即可。因此，近年来一些在油菜中成熟使用的CMS在薹用白菜杂交品种选育中也被广泛应用。Polima CMS是由华中农业大学从甘蓝型油菜中发现，并最早在油菜育种中成熟应用的CMS类型，其不育性由orf 224基因控制[9]。Polima CMS已被转育到其他十字花科蔬菜如红菜薹、小白菜中，但该类型CMS本身在甘蓝型油菜中便存在微粉的现象，其微粉程度在遗传背景变异较大的十字花科蔬菜中变得更不稳定，对其应用也产生了一定限制[10-11]。Ogura CMS也是在油菜中应用较为成功的CMS，败育彻底，最初在萝卜中发现并通过细胞工程手段导入到了油菜中，其不育性由orf 138基因控制[12-13]。已有的研究表明，Ogura CMS在转育到不同类型十字花科蔬菜如芥菜、白菜与甘蓝类蔬菜后，仍可保持败育彻底的特性，因此Ogura CMS也是现阶段在十字花科蔬菜中广泛应用的CMS类型[14-16]。Hau CMS是在芥菜中发现的败育彻底型CMS，也是华中农业大学继Polima CMS后发现的另一个在油菜中具有应用价值的CMS类型，其败育特性由orf 288基因控制，通过远缘杂交导入到油菜中后仍能保持败育彻底的特性[17]，目前该CMS在菜心及白菜薹育种中已有成功应用的研究报道[18-19]。

现阶段Polima，Ogura与Hau CMS类型均已转育到薹用白菜中，与使用原始的不育源或油菜作为不育胞质供体相比，以已有的CMS薹用白菜不育系及性状优良的CMS杂交品种作为不育胞质供体可提高不育系的创制效率，如近年来新育成的白菜薹品种天成早薹1号、菜心品种粤翠2号及红菜薹品种申紫薹仙均是基于已有的薹用白菜不育系进行的母本不育系转育[7，20-21]。市场上同时存在不同类型的CMS杂交品种，也为育种家创制不同类型CMS杂交种提供了便利。然而一些CMS类型的败育特征较为相似，如Ogura与Hau CMS，在育种实践中笔者也发现已有的Polima分子标记无法将Polima与Hau CMS区分开。同时笔者也发现了一些具有特殊败育特征的薹用白菜商品种，然而由于多数商品种的来源与选育信息无法获取，现阶段需要特异性更强的CMS类型鉴定分子标记，以实现对当前薹用白菜品种CMS类型的精准鉴定。

基于以上问题，笔者对已报道在薹用白菜品种选育中使用的Polima、Ogura及Hau CMS进行序列分析，开发特异性分子标记，首先解决现有Polima分子标记在Hau CMS中的假阳性问题，进一步设计多重PCR聚合分子标记，能够同时对3种不育胞质与正常可育胞质进行检测，并利用开发的特异性标记对收集的薹用白菜CMS类型进行鉴定。研究结果可为当前薹用白菜育种提供精准高效的CMS鉴定分子标记，同时也可厘清当前薹用白菜育种中CMS的应用特征。

1 材料与方法

1.1 材料

笔者前期通过武汉市大东门种子市场与湖北汉蔬创一农业科技有限公司收集了一批主流的红菜薹、白菜薹与菜心商品种以及处于初步示范阶段的杂交组合，于2021、2022及2023年的2－5月份在湖北省农业科学院杨家堰试验基地内进行育性观察，将其中符合CMS遗传特性即当代表现出不育特性、作母本与常规可育材料杂交后的F1代仍能保持不育特性的28个品种/组合用于本试验（表1）。其中HCT1801与BCT1815为2个特殊育性材料，二者大部分单株均败育彻底，但均存在少量不完全败育的单株。Ogura CMS对照材料紫御60、鄂红5号与Polima CMS对照材料靓红70、鄂红2号均为湖北省农业科学院薹用蔬菜研究团队自主培育的红菜薹杂交品种。Hau CMS对照材料JC73A由华中农业大学万正杰教授提供，Ogura恢复系对照材料由中国农业科学院油料作物研究所胡琼研究员提供，其他作为可育对照的材料均为湖北省农业科学院薹用蔬菜研究团队保存的种质资源与自交系。

1.2 方法

1.2.1 不同CMS类型序列特异性比对 将Polima CMS、Ogura CMS及Hau CMS对应基因orf 224、orf 138及orf 288的基因序列分别与NCBI数据库中的Polima CMS、Ogura CMS、Hau CMS的线粒体基因组序列（NCBI登录号依次为FR715249，AB694744，KF736092）、白菜正常胞质的线粒体基因组序列（NC_016125）及核基因组序列（GCF_000309985）进行逐一比对，根据同源性序列的水平来评估3个CMS类型基因的特异性。其中基因与线粒体/核基因组间的比对利用NCBI中的序列间Blast功能完成，鉴定到高度同源的序列后，进一步使用EMBL-EBI数据库中的MUSCLE软件对同源性序列进行比对分析[22]。

1.2.2 特异性分子标记的设计 对于存在同源性序列干扰的CMS基因，采取等位基因特异性PCR的策略[23]，在同源序列存在变异较大的区域设计引物，并通过在引物3’端引入碱基错配的方式提升引物扩增的特异性，初步完成标记设计后，使用不同类型的薹用白菜品种将新标记与该CMS已有的标记进行检测效果比较，确定新标记的特异性。对于序列特异性较强的CMS基因，直接以其序列为模板进行引物设计。为了开发具有共显性特征的CMS类型鉴定分子标记，利用正常胞质与3种类型CMS胞质间的保守序列区域设计通用引物，保守区域通过mVISTA比对软件进行鉴定和获取[24]。获得3种CMS类型的特异引物及与正常胞质间的通用引物后，将不同引物对混合在一起进行测试，根据扩增效果调整各引物对比例，获取最佳检测效果，最终得到可区分3种CMS及正常可育胞质的CMS多重PCR分子标记。在标记开发过程中引物设计相关的退火温度评估与二聚体分析均使用Oligo 7软件完成[25]。