不同液体培养基质与模式对星孢寄生菇生长发育的影响

摘    要：为探究星孢寄生菇的生长发育过程及其与基质的关系，采用液体摇瓶与静置发酵的方法，分析了12种发酵基质对该菇个体发育的影响。结果表明，木屑基质上该菇在摇瓶培养中菌丝萌发和菌球形成的时间长且经静置培养后所有子实体上布满厚垣孢子的周期最短（14 d），而鸡粪基质上周期最长，棉籽壳、黑豆、香菇以及灰肉红菇基质上子实体发育最为正常。发酵液pH从菌丝生长期至厚垣孢子形成期逐渐增加，其体积逐渐减小且在不同基质上因发育时期的不同差异较大。菇类与黑豆有利于该菇摇瓶发酵阶段生物量的积累，棉籽壳与菌糠可以促进静置发酵阶段的生物量，木屑、灵芝及菌糠有利于提高其绝对生物学效率与菌球形成率。综上所述，营养因子的变化直接影响星孢寄生菇的形态发生、菌体转化、厚垣孢子形成等生长发育过程，研究结果可为加快其他珍稀菇类的开发利用进程提供理论参考。

关键词：星孢寄生菇；液体基质；摇动培养；静置培养；个体发育

中图分类号：S646.9 文献标志码：A 文章编号：1673-2871（2023）12-085-08

Effects of different liquid fermentation matrix and modes on the growth and development of Asterophora lycoperdoides

PENG Zeqin， TANG Rongping， ZHOU Huiming， WANG Ting， XIAO Longbin， WANG Ying， ZHU Yuan’ai， CUI Yutong， LI Xianlin

（School of Biotechnology and Engineering， West Yunnan University， Lincang 677000， Yunnan， China）

Abstract： To explore the growth and development process of Asterophora lycoperdoides and its relationship with matrix， the effects of 12 culture matrix on its the ontogenetic development were analyzed using the liquid shake flask and static fermentation. The results showed that the time of mycelium germination and ball formation of A. lycoperdoides was long in shake flask culture on sawdust matrix， and the cycle of all fruiting bodies covered with chlamydospores was the shortest（14 d）after static culture， while the cycle on the chicken manure matrix was the longest. The fruiting bodies on the matrix of cottonseed husk， black beans， Lentinus edodes and Russula griseocarnosa matrix were the most normal. The pH value of the culture liquid increased gradually from mycelial growth period to chlamydospore formation period， and its volume decreases gradually and varies greatly in different matrix due to different development period. Mushrooms and black beans are conducive to the accumulation of its biomass in the shake flask fermentation stage， cottonseed husk and fungus chaff can promote the biomass in the static culture stage， sawdust， Ganoderma lucidum and fungus chaff are conducive to improve the absolute biological efficiency and the formation rate of mycelium balls. In conclusion， the changes of nutritional factors directly affect the growth and development process and results of A. lycoperdoides， such as morphogenesis， thallus transformation， and chlamydospore formation， which provides a theoretical reference for accelerating the development and utilization of other rare mushrooms.

Key words： Asterophora lycoperdoides; Liquid matrix; Shaking culture; Static culture; Ontogeny

星孢寄生菇（Asterophora lycoperdoides）是一种兼有寄生与腐生营养方式的寄生菇属（Asterophora）真菌，既寄生于红菇属真菌黑菇（Russula adusta）、稀褶黑菇（R. nigricans）、密褶黑菇（R. densifolia）等变黑且腐烂的子实体菌盖中央、菌褶及菌柄之上并拥有担孢子与厚垣孢子两大孢子体系，又在人工培养基上比普通菇类更容易栽培出菇[1-2]。营养生理是众多野生珍稀菇类人工驯化解决的首要问题，个体发育是菇类营养生理在菌体转化与形态发生不同阶段的直观体现，独特的营养方式又是菇类基于遗传特性对外界营养胁迫的一种生存适应性，因此，独特的星孢寄生菇是研究担子菌个体发育的理想材料，探究营养因子变化对其个体发育的影响，有助于弄清该菇生长发育过程及其与基质的关系，同时也为弄清其他腐生与寄生野生菇类营养需求机制提供有利的理论参考。

目前，针对星孢寄生菇的种质资源评价[3]、形态学分类[4]、亲缘关系分析[5]等研究报道居多，而有关营养生理的研究比较滞后。王建东等[6]采用固体基质培养法对其基础培养基、碳氮源、pH以及温度仅进行了初步试验，然而，目前诸多野生菇类生长环境遭到人为破坏[7]且未受到有效保护与利用[8]，菇类个体发育因缺乏合适的材料已成为食用菌领域研究的难点[9]，且受外界条件[10-14]与内在因素[15-16]的影响极为显著。因此，针对星孢寄生菇个体发育与营养基质关系的研究，寻找影响菇体驯化出菇的营养障碍，对开发其他珍稀菇类有重要的参考意义。

菇类的个体发育过程受营养条件影响较大[17-19]。液体培养比固体培养更容易观察和测定菇类菌丝体的生长变化情况。笔者基于星孢寄生菇容易培养出菇的特性，采用液体摇动与静置培养相结合的方法，分析了营养变化对该菇整个生活史中菌丝生长期、子实体形成期、厚垣孢子形成期3个重要时期生长发育过程的影响，以期为其他珍稀大型真菌的开发利用提供一定的理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株 星孢寄生菇保存于云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所，菌株编号：YAASM4665。新鲜的水葫芦采集于滇西科技师范学院人工湖，灵芝、荷叶离褶伞、香菇由食用菌课题组提供新鲜完整子实体和灵芝菌糠，剩余添加材料均购买于云南省临沧市批发市场。

1.1.2 培养基 以基础培养基（马铃薯200 g、蔗糖20 g、水1 L，pH自然）为对照配方1，添加经200目筛且80 ℃下烘干处理的水葫芦（配方2）、木屑（配方3）、棉籽壳（配方4）、鸡粪（配方5）、黑豆（配方6）、菌糠（配方7）、灵芝（配方8）、荷叶离褶伞（配方9）、香菇（配方10）、野生香菇（配方11）、灰肉红菇（配方12）的超细粉各3 g依次制备成液体培养基配方，取100 mL培养液分装于250 mL的三角瓶中，每处理9次重复，采用封口膜及4层报纸封口，121 ℃下灭菌30 min，冷却至30 ℃左右接种。

1.2 方法

1.2.1 菌株活化与接菌 试验于2022年5月在滇西科技师范学院食用菌实训室内进行。将该菇母种在室温下培养6 d，然后接种于PSA（马铃薯200 g、蔗糖20 g、琼脂20 g、水1 L，pH自然）培养基平板中，于25 ℃下培养7 d。在无菌操作下取5块直径5 mm的同心圆菌落接入上述液体培养基内[20]并将摇瓶置于摇床内在25 ℃下静置培养。

1.2.2 液体摇动培养 摇瓶静置培养24 h后，调节摇床转速，在150 r·min-1下进行摇动培养，记录菌丝萌发和菌球形成的时间（d）。培养12 d后，每组随机选取3个摇瓶，测定菌丝形成期培养液的体积（mL）、pH、颜色、气味，菌球颜色、形状、气味、数量（个·mL-1）、直径（mm）及生长速度（mm·d-1）。将菌球（培养液经5层纱布过滤）在80 ℃下烘干至恒质量，然后称质量即菌球生物量（mg·mL-1）[21]。菌球形成率/%=菌球干质量/基质干质量×100。

1.2.3 液体静置培养 在培养物经摇动培养12 d后转为静置培养，记录其表面原基、菌膜、菇蕾、幼菇、厚垣孢子初期（第一朵子实体出现厚垣孢子）、厚垣孢子中期（超过1/2的子实体出现厚垣孢子）、厚垣孢子后期（全部子实体出现厚垣孢子）形成时间（d）。当菌液表面出现10～25个子实体时，随机选取3瓶培养物，测定子实体形成期上述各项参数，菌膜与子实体生物量的测定方法与菌球生物量相同，生物量=菌球生物量+菌膜生物量+子实体生物量，绝对生物学效率/%=子实体鲜质量/基质干质量×100。当培养物表面所有子实体均出现厚垣孢子时为厚垣孢子形成期，测定参数同1.2.2。

1.3 统计分析

采用SPSS 19.0 统计软件对上述试验结果进行差异显著性分析[22]。

2 结果与分析

2.1 不同液体基质对星孢寄生菇个体发育的影响

由图1可知，不同基质对该菇3个发育时期的培养液色泽、菌球、菌膜等生长特征、周期、颜色及气味影响较大。添加棉籽壳、黑豆、香菇以及灰肉红菇的基质上该菇子实体发育正常，其余基质上均出现不同程度的畸形菇，以木屑与荷叶离褶伞基质畸形菇最为严重。培养液多为淡黄色、腐木味或菇香味；菌球以枯茶色、腐木味、球形略多，但添加木屑、棉籽壳、菌糠的基质中菌球为椭球形；菌膜在子实体形成期主要为亚麻色与淡黄色，厚垣孢子形成期以香色、亚麻色及练色为主，添加黑豆的基质上为淡黄色，添加荷叶离褶伞与野生香菇的基质上为亚麻色，添加菇类的基质上以亚麻色居多；子实体在其形成期以灰白色、菇香味为主，少数为白色、无味；厚垣孢子形成期以肌色为主，部分乳白色、灰白色及象牙色，菇香味，添加黑豆的基质上为灰白色，越到后期其菇香味越明显。

液体摇动培养阶段，与对照相比，除添加木屑的基质不利于该菇菌丝萌发（3 d）和菌球形成（5 d）外，在其他基质上菌丝萌发（2 d）和菌球形成（3 d）的时间相同（图2）。液体静置培养阶段，该菇在不同基质上从原基形成至所有子实体上出现厚垣孢子的周期由长至短依次为添加鸡粪、黑豆、灰肉红菇、棉籽壳、菌糠、水葫芦、对照、荷叶离褶伞、野生香菇、香菇、灵芝、木屑的基质。与对照相比，添加木屑的基质最有利于缩短原基、菌膜、菇蕾等农艺性状的形成时间，尤其是所有子实体上布满厚垣孢子的周期最短（14 d），其次是灵芝、香菇、野生香菇基质，而添加鸡粪的基质上，该菇上述农艺性状的形成时间最长，其中厚垣孢子布满所有子实体的周期达到30 d，与其余配方相比呈极显著差异，其次是黑豆、灰肉红菇、棉籽壳。