韭菜灰霉病菌对嘧霉胺和咯菌腈抗性评价及抗性菌株适合度分析

摘    要：为研究韭菜灰霉病菌对嘧霉胺和咯菌腈的抗性水平及抗性菌株适合度的影响，在甘肃不同区域采集并分离出54株韭菜灰霉病菌，采用抗药性MIC法（最低抑制浓度法）、菌丝生长速率法分别测定嘧霉胺和咯菌腈对灰霉病菌的最低抑制浓度及抗性菌株的敏感性，以此划分敏感菌株和抗性菌株，确定其抗性水平，分析抗性菌株的遗传稳定性及适合度。结果表明，嘧霉胺和咯菌腈对54株灰霉病病菌的最低抑制浓度分别为4.80和0.15 μg·mL-1，抗性频率分别为35.19%和9.26%。灰霉病菌对嘧霉胺和咯菌腈的抗性分别表现为中抗、高抗和低抗水平；低抗菌株抗嘧霉胺特性不能稳定遗传，转代培养后有向敏感菌株发展的趋势。对嘧霉胺产生抗性的菌株，其适合度显著低于敏感菌株，在与敏感菌株的竞争中不占优势；对咯菌腈产生抗性的低抗菌株，其适合度与敏感菌株相当。

关键词：韭菜；灰霉病；嘧霉胺；咯菌腈；抗性评价；适合度

中图分类号：S633.3 文献标志码：A 文章编号：1673-2871（2023）12-107-06

Evaluation of resistance of Chinese chive gray mold（Botrytis cinerea） against pyrimethanil and fludioxonil and the suitability of resistant strains

ZHANG Yanli1， CHEN Juan2， ZHANG Yixiao1， CHEN Yanling1

（1. Pingliang Agricultural Products Quality Safety and Inspection and Testing Center， Pingliang 744000， Gansu， China; 2. Gansu Academy of Agricultural Sciences， Lanzhou 730000， Gansu， China）

Abstract： In order to clarify the sensitivity level of the pathogen of Chinese chiv gray mold to pyrimethanil and fludioxonil in different regions of Gansu province， fifty-four strains were collected and isolated from  the disease plants in different regions. In order to divide the sensitive and resistant strains， the minimum inhibitory concentrations of pyrimethanil and fludioxonil were determined by the MIC method （minimum inhibitory concentration method）. The susceptibility of resistant strains to pyrimethanil and fluxonil was determined by mycelium growth rate method， and their resistance levels to the two fungicides were also tested. The genetic stability and fitness of resistant strains were further analyzed. The minimum inhibitory concentrations of pyrimethanil and fludioxonil against fifty-four strains of Botrytis cinerea were 4.8， 0.15 μg·L-1， respectively. The resistance frequency was 35.19% and 9.26% respectively. The resistance of the pathogen of B. cinerea to pyrimethanil was medium and high， low resistance to fludioxonil. The low resistance strains against pyrimethanil can not be inherited stably. However， there was a trend towards greater sensitivity to pyrimethanil after subculture. The suitability of pyrimetrium-resistant strains was significantly lower than that of pyrimetrium sensitive strains. The pyrimetrium-resistant strains were not superior in competition with sensitive strains. The suitability of the fluroxonitrile resistant strains was similar to that of the fluroxonitrile sensitive strains.

Key words： Chinese chives; Gray mold; Pyrimethanil; Fludioxonil; Resistance evaluation; Fitness

韭菜是我国栽培区域最广泛的蔬菜之一。近年来，在韭菜种植过程中灰霉病时常发生，成为影响韭菜安全生产的重要因素之一。韭菜灰霉病是由灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）引起的一种病害[1]，直接影响韭菜的产量和品质。防治韭菜灰霉病的登记农药有腐霉利、嘧霉胺和咯菌腈3种。腐霉利作为二甲酰亚胺类杀菌剂在我国有20～30年的使用历史，已表现出灰霉病菌对腐霉利的敏感性下降[2]，且腐霉利在蔬菜中检出的农药残留频率最高[3-4]。研究表明，其他蔬菜上灰霉病菌对嘧霉胺的抗性频率已达到43.64%[5]，不同地区灰霉病菌对嘧霉胺的抗性水平有差异，但其抗性菌株的适合度鲜有报道。咯菌腈对灰霉病菌菌丝生长有较高的抑制作用，在国内已有灰霉病病菌对咯菌腈产生抗性的报道[6]。陈淑宁等[7]研究表明，在咯菌腈药剂条件下，灰霉病菌敏感菌株可以在竞争中淘汰掉多重抗性菌株。目前在甘肃省内还没有关于韭菜灰霉病菌对嘧霉胺和咯菌腈抗药性的报道，且GB 2763－2021[8]中还未规定嘧霉胺在韭菜中的最大残留限量值。为此，笔者通过对甘肃省7个地州市（张掖、武威、陇南、庆阳、平凉、兰州、白银）的韭菜灰霉病菌进行分离及敏感性检测，并对其进行抗性评价，以期研究抗性菌株的适合度，用于指导甘肃省境内田间韭菜种植的科学用药和杀菌剂抗性管理。

1 材料与方法

1.1 供试材料

99.9%嘧霉胺、咯菌腈原液1000 μg·mL-1，由北京莱铂锐科技有限公司提供。嘧霉胺、咯菌腈原液用丙酮配制成100 μg·mL-1母液，冰箱冷藏保存。马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）[9]用于韭菜灰霉病菌对咯菌腈的敏感性测定；L-asp培养基[10]用于韭菜灰霉病菌对嘧霉胺的敏感性测定。

试验于2020年3－11月在甘肃省陇中（兰州、白银），陇东（庆阳、平凉市），陇南和河西（张掖、武威市）等7个市的设施大棚内开展。采集韭菜灰霉病病叶，采用何烈干等[11]的方法纯化分离菌株，得到54株菌株，经形态学和分子生物学鉴定为灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）[12]，所有菌株在4 ℃下保存。菌株命名以“采样市州+序列号”表示。

1.2 敏感基线建立及抗性水平测定

采用抗药性鉴定MIC法（最低抑制浓度法），在分离出的54株灰霉病菌菌落边缘打取直径5 mm的菌丝块，分别接种至含系列浓度的嘧霉胺和咯菌腈的L-asp、PDA培养基上，每处理3次重复。在25 ℃培养12 d后，不能或几乎不能在该培养基上生长的药剂浓度为嘧霉胺和咯菌腈对韭菜灰霉病菌的最低抑制浓度，以此划分敏感菌株和抗性菌株。

采用菌丝生长速率法[11]分别测定韭菜灰霉病菌对嘧霉胺、咯菌腈的敏感性，对嘧霉胺敏感菌株浓度（ρ）设定分别为0.05、0.1、0.5、1.0、2.0 μg·mL-1，抗性菌株浓度设定分别为1.0、2.0、3.0、5.0、10.0 μg·mL-1；咯菌腈浓度设定分别为0.01、0.05、0.1、0.2、0.3 μg·mL-1。以不加药剂作为对照，将打取的菌饼（5 mm）接种于平板培养基上，每处理3次重复，在25 ℃恒温培养6 d。采用十字交叉法测定菌落直径，利用Graphpad prism 5.0软件处理后得出EC50值。

分别选取嘧霉胺压力下32株和咯菌腈压力下54株菌株EC50值进行正态分布验证，以符合该正态分布所有菌株的平均EC50值为敏感基线，作为比较抗性有无和抗性水平高低的标准。根据抗性菌株与敏感基线EC50的比值确定抗性倍数[13]，1≤抗性倍数≤5时，为低抗菌株（LR）；5＜抗性倍数≤10时，为中抗菌株；抗性倍数＞10时，为高抗菌株。

1.3 抗性菌株稳定性测定

在嘧霉胺压力下，挑选菌株PL-2（低抗）、BY-6（中抗）和LZ-3（高抗）；在咯菌腈压力下选取菌株QY-6（低抗菌株）分别在L-asp和PDA无药培养基上连续转代培养8次后，分别测定第2、4、6、8代菌株对药剂的敏感性，比较继代前后菌株间抗药性水平（EC50）差异。

1.4 抗性菌株适合度测定

1.4.1 抗/敏菌株菌丝生长速率及产孢量的测定 选取菌株ZY-3、PL-2、BY-6、LZ-3和PL-4、QY-6，在其菌落边缘打取直径5 mm菌饼，分别接种于L-asp、PDA平板上，在25 ℃下培养，分别测量生长12、24、48、72和96 h后的菌落直径，计算菌株生长速率。将上述菌株继续培养10 d后，用10 mL无菌水冲洗孢子，尼龙纱布过滤，定容后采用血球计数板计数。每个菌株3次重复。

1.4.2 抗/敏菌株致病性测定 采用任璐等[14]的方法。将采集到的同叶位韭菜叶清洗消毒后，制成3 cm的叶盘。分别配置嘧霉胺、咯菌腈最低抑制浓度溶液，将叶盘浸入药液2 min后，晾干，以浸入无菌水为对照；将1.4.1中制备的孢子液稀释至1×104个·mL-1，均匀喷洒于叶盘，放入无菌培养皿中，每皿4片，每处理3次重复，用透明坐标纸统计叶盘发病面积，按公式（1）计算发病率。

发病率/%=叶片发病面积/叶片总面积×100。                                                                                （1）

1.4.3 抗/敏菌株分生孢子竞争力测定 参照史晓晶等[15]的方法，对嘧霉胺和咯菌腈的敏感菌株与抗性菌株孢子液按体积比1∶1配置成不同的组合：Cp1为ZY-3+PL-2，Cp2为ZY-3+BY-6，Cp3为ZY-3+LZ-3，Cf4为 PL-4+QY-6。将孢子混合液用毛笔涂抹于无菌韭菜叶片上，在25 ℃培养，发病后打取1 cm病斑叶片悬浮于嘧霉胺、咯菌腈最低抑制浓度溶液中继续培养，记录病斑数量并观察病斑是否扩大，每个处理检测病斑数50个。按公式（2）计算抗性突变体频率。