制干辣椒果实辣椒素对干旱、盐及其双重胁迫的响应

摘    要：为明确干旱、盐等环境因素对制干椒辣椒素含量的影响，试验以红龙23号板椒为材料，从现蕾期开始设置不同土壤含水量65%（W1）、45%（W2）和NaCl（S1=120 mmol·L-1）及盐旱复合处理（W1S1、W2S1），利用高效液相色谱法分析转色期果实辣椒素素含量，并送样进行转录组测序。结果表明，W1处理下辣椒素含量较对照增加107.11%，W2处理时辣椒素含量下降73.01%;含盐处理均能提高辣椒素含量，其中W2S1处理的较对照高392%。盐、旱胁迫主要影响苯丙烷生物合成途径，其中HCT、4CL、CAD等基因表达受影响较大;聚类分析表明BCKDHE2、ENRb等基因主要响应干旱胁迫，CCR、GS2 主要响应盐胁迫。由上可知，适度干旱和盐胁迫均能提高辣椒素含量;干旱加剧时与盐分的复合效应更显著，对辣椒素积累的促进作用更大。

关键词：辣椒素;干旱胁迫;盐胁迫;双重胁迫;转录组

中图分类号：S641.3 文献标识码：A 文章编号：1673-2871（2022）02-078-07

Capsaicin of dry pepper fruit grown under drought， salt and combined stress condition

LÜ Hui， JI Xuehua， ZHANG Zhongrong， ZHU Ranran， WANG Shining， XIE Xueguo， YUAN Lei

（Agricultural College of Shihezi University/Key Laboratory of Special Fruits and Vegetables Cultivation Physiology and Germplasm Resources Utilization， Shihezi 832000， Xinjiang， China）

Abstract： Honglong 23 pepper was cultivated in pots stressed with drought and salt from budding to fruit color break to understand the effects of stress on capsaicin in pepper fruit for drying. Soil water contents were 65% （W1） and 45% （W2） of saturated content， NaCl concentration was 120 mmol·L-1（S1）， and combined stresses were W1S1 and W2S1. Capsaicin contents were measured with HLPC， transcriptional data was analyzed by Personal Biotechnology Co Ltd. The results showed that the capsaicin content of pepper fruit under W1 treatment was 107.11% higher than that of the control， and the capsaicin content with W2 treatment was 73.01% lower than that of the control. Salt treatments （S1， W1S1， W2S1） increased the capsaicin content， and the capsaicin content in W2S1 treatment was 3.92 times of the control. Salt and drought stresses mainly affected the phenylpropane biosynthesis pathway of capsaicin， and had a great impact on the expression of HCT， 4CL， CAD genes in phenylpropane pathway. Cluster analysis showed that CPR， pAMT2 genes responded to the three stresses， while BCKDH E2， ENRb mainly responded to water stress， CCR and GS2 mainly responded to salt stress. Moderate drought and salt stress can increase the content of capsaicin in fruits. The combination of severe drought and salt had the most significant effect on capsaicin， while the mild drought and salt had little effect.

Key words： Capsaicin; Drought stress; Salt stress; Combined stress; Transcriptome

辣椒因其特殊的风味，备受人们的喜欢，而制干辣椒是新疆新兴的特色经济作物，随着种植规模的不断扩大，新疆已成为全国制干椒的原料生产基地。制干辣椒可用于提取辣椒素、辣椒红素等高附加值产品[1-2]。辣椒素类化合物是辣椒产生辛辣味的主要来源物质，同时也是评价制干辣椒果实品质的重要指标。研究表明辣椒素类物质有30多种，其中辣椒碱和二氢辣椒碱是辣椒素主要成分，占果实辣椒素总含量的90%[3-4]。辣椒素作为一种次生代谢产物，在农药研发、军事防御、食品加工、医学药理、临床研究等方面被广泛使用[5-7]。辣椒素主要在果实胎座中形成，其含量较低，供不应求，限制了其在市场中的大量使用[8]。因此，提高辣椒素含量是辣椒栽培和育种环节的重要目标。

辣椒素类物质的合成途径主要有两条：苯丙氨酸途径和支链脂肪酸途径[3，9-10]。多个基因参与了上述两条途径。目前已克隆的辣椒素代谢相关基因有PAL、C4H、CoAOMT、pAMT、KAS、ACL、FAT、ACS和AT3 等基因[11-12]。研究表明果实胎座中的C4H、CoAOMT、pAMT、KAS、AT3等基因的表达量与辣椒素含量呈正相关关系[13]。

辣椒素的含量不仅取决于基因型，还受到外界环境的影响。张海英[14]研究表明碱性盐胁迫可以显著提高红熟果中辣椒素的含量。新疆气候干旱、水资源短缺，而地表蒸腾强烈，因此盐碱土面积较大。实际生产中制干辣椒生长期面临着盐碱和干旱的双重胁迫[15]。目前，对辣椒素的环境影响研究主要集中在单一因素，且多在生理方面开展，对复合胁迫下的变化报道较少。

笔者以制约新疆制干辣椒生长的两个关键环境因子干旱和盐为出发点，采用高效液相色谱和转录组测序技术，分析辣椒素代谢相关基因在干旱、盐及双重胁迫下的表达，结合辣椒素含量的变化，明确其对干旱、盐及复合胁迫的响应差异，为农业生产中提高制干椒辣椒素含量提供理论指导。

1 材料和方法

1.1 材料

试验材料为加工辣椒品种红龙23号羊角椒，由新疆天椒红安农业科技有限公司提供。

1.2 试验设计

试验采用完全随机方式，2020年3—8月于新疆石河子大学农学院试验站日光温室进行（85°59′E，44°18′N）。将催芽后的红龙23号种子播种到体积比草炭∶蛭石=2∶1的穴盘中（尺寸为540 mm×280 mm），待其至6片真叶时定植于盆土体积比为草炭和蛭石（2∶1）∶园土（杀菌消毒）∶沙子=2∶4∶1的花盆（30 cm×45 cm）中，每盆质量8 kg。试验设置3个水分梯度：正常水分W0（土壤相对含水量为100%）、轻度干旱W1（土壤相对含水量为65%）、中度干旱W2（土壤相对含水量为45%）;2个盐浓度：无盐S0（NaCl=0 mmol·L-1）、重度盐S1（120 mmol·L-1），共6组处理，分别为CK（W0S0）、干旱胁迫（W1、W2）、盐胁迫组（S1）、盐旱双重胁迫（W1S1、W2S1）组（具体见表1）。试验于花后7 d进行处理，每处理10盆，每盆3株重复。采用称质量法控制水分含量，每2～3 d称质量1次;盐分通过电导率控制，每2～3 d测定1次。处理后20 d于转色期采果实测定。各处理选第2～4层果实2～3个置于液氮速冻，-80 ℃保存。

1.3 指标测定

1.3.1    辣椒素含量的测定方法    参照厉志伟等[16]和张海英[14]的方法稍加改进。将辣椒果实置于105 ℃杀青30 min，而后于50 ℃烘干至恒重，在60 ℃水浴中超声辅助甲醇提取样品中辣椒素及二氢辣椒素。用LC-2010AHT高效液相色谱仪进行辣椒碱及二氢辣椒素的HPLC 测定。流动相体积比为甲醇∶超纯水=80∶20，检测波长为280 nm，流速为1.0 mL·min-1，柱温为30 ℃，进样量为10 μL。总辣椒素含量=（辣椒素含量+二氢辣椒素）/90%。

1.3.2    Illumina测序及测序数据的分析    委托南京派森诺基因科技有限公司进行Illumina测序。原始下机数据（Raw Data）经过过滤，去除带接头、低质量的Reads后得到高质量序列（Clean Data），将过滤后的Reads比对到参考基因组GCF_000710875.1_Pepper_Zunla_1_Ref_v1.0_genomic.fna进行对比，对比对上的Reads进行拼接，还原出转录本序列;分析比对所得基因功能注释，所用的数据库为GO（Gene Ontology），KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）。

根据对照组（CK）和各处理组间基因表达量对比进行差异表达分析，以表达差异倍数 |log2 FoldChange| > 1、显著性以p < 0.05作为筛选差异表达基因条件，并对差异表达基因进行代谢通路富集分析。

1.3.3    差异基因的qRT-PCR验证    选取差异表达基因并采用Trizol试剂提取果实的RNA，利用PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser试剂盒进行反转录，引物序列的设计及合成均由上海生工生物工程公司完成。每处理的每个基因3次重复，按照2-ΔΔCt相对定量法计算基因相对表达量。

1.4 数据处理

所得的试验数据采用Excel 2010、SPSS17.0软件进行统计分析，用Origin 9.0软件进行作图。聚类分析采用在线软件Clust Vis制作：https：//biit.cs.ut.ee/clustvis。

2 结果与分析

2.1 干旱、盐及双重胁迫对辣椒果实中辣椒素含量的影响

由图1 可知，轻度干旱、盐及双重胁迫均有利于果实辣椒素的积累，且果实中辣椒素含量与对照（CK）相比差异显著。单一胁迫时，S1中辣椒素增加幅度较W1小;且辣椒素含量随着干旱程度的加剧而急剧减少，W1较对照显著提高了107.11%，W2较对照显著减少了73.01%。双重胁迫下，W1S1处理的辣椒素较对照显著增加了43.55%，较W1显著下降了30.69%，但与S1间差异不显著。W2S1的辣椒素含量较对照显著提高了3.92倍，较W2显著提高了12.69倍，较S1显著提高了2.61倍。上述结果说明适度的干旱和盐胁迫均能提高辣椒素含量，重度干旱时盐旱互作明显。

2.2 干旱、盐及双重胁迫下辣椒果实差异表达基因分析