黄瓜穴盘苗期枯萎病抗性鉴定方法及枯萎病胁迫下的生理响应

作者: 杨凡 唐艳领 牛莉莉 马凯 王晨阳 米国全 余其红 史宣杰

黄瓜穴盘苗期枯萎病抗性鉴定方法及枯萎病胁迫下的生理响应 0

摘要:建立黄瓜枯萎病接种方法,旨在实现快速、准确的黄瓜种质资源抗病性筛选。利用下胚轴注射、菌土、胚根和灌根接种法对病原菌接种浓度、摇菌时间等进行了黄瓜苗期枯萎病抗性鉴定。结果表明,下胚轴注射接种法优于其他3 种接种法,当病原菌孢子最适接种浓度为1×106 孢子·mL-1、最佳菌种摇菌时间为7 d 时,可以有效区分黄瓜枯萎病抗感性差异。下胚轴注射接种法适用于黄瓜种质枯萎病抗性快速高效鉴定。

关键词:黄瓜枯萎病;尖孢镰刀菌病原菌;抗病性鉴定

中图分类号:S642.2 文献标志码:A 文章编号:1673-2871(2022)03-081-05

Abstract: A fast and accurate evaluation of cucumber seedling resistance to Fusarium wilt is needed. We tested hypocotylinjection, pathogen infested soil, radicle and root inoculation in this study. Inoculum of Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinumwith different concentration and medium culture periods were used for the tests. The results showed that the hypocotylinjection was better than the other three inoculation methods. The best inoculation concentration was 1×106 spores·mL-1and the best pathogen culturing period was 7 d for identifying Fusarium wilt resistance in cucumber cultivars. The hypocotylinjection method is suggested for screening cucumber germplasm resistance to Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum.

Key words:Fusarium wilt disease; Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum; Resistance evaluation

黄瓜是世界蔬菜主栽作物之一,在我国是实现农民增收、农业增效、农村经济发展及乡村振兴的重要支柱。黄瓜枯萎病是一种全球性毁灭性病害,是植物中的“癌症”,发病率一般在15%~35%,严重时可达85%,甚至绝收[1]。随着我国设施黄瓜种植面积增加,连作栽培往往导致毁种失收,严重影响着我国不同栽培条件下黄瓜品质及产量,已经成为阻碍黄瓜生产的主要因素[2]。黄瓜枯萎病是一种导管侵染性土壤传播病害,化学及农业等防治方法均难以控制[3]。实践证明,抗病品种培育与利用是防治黄瓜枯萎病最经济有效的手段,而制定出快速简便、准确有效的抗病性鉴定评价方法,则有助于加速抗病育种的进程[4]。

国内外对黄瓜枯萎病抗性鉴定方法多样,未有统一技术标准,特别是在苗期鉴定[5]。国外黄瓜苗期枯萎病抗性鉴定方法主要采用灌根接种、菌土接种和蘸根接种等3 种方法,国内流行的则是灌根、浸根和胚根等接种法,此外毒素浸根也被用来评价黄瓜枯萎病抗性[6-8]。但所采用的鉴定方法、病情分级标准等不一致,造成了抗性鉴定的准确性和稳定性差异较大,无法真实反映黄瓜品种抗病水平。因此,本试验旨在建立一套快速准确、实用稳定的人工接种抗病性鉴定技术,为提高黄瓜抗病育种效率和培育抗病品种提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

供试抗性品种博杰616 和博美310,感病品种博杰605 均由河南省庆发种业有限公司提供。感病品种津研4 号购自于种子市场。黄瓜种子温汤处理催芽,待胚根长0.5 cm 备用。各处理种子1 穴1 粒,播于40 孔穴盘(穴盘规格:长×宽=540 mm×280 mm)。

供试病原菌为黄瓜枯萎病病原菌4 号生理小种,由河南省农业科学院园艺研究所提供。采用翁祖信等[8]方法制备黄瓜枯萎病菌4 号生理小种病原菌分生孢子液,稍作改动。该菌株在PDA 培养基(配方:马铃薯200 g,葡萄糖15 g,琼脂粉18 g,蒸馏水1000 mL,高温湿热灭菌)上25 ℃黑暗条件下培养3 d,从菌落边缘取直径5 mm 的菌饼3 块,接种在含有100 mL PDB 培养基的250 mL 的三角瓶中,25 ℃,250 r ·min-1,振荡培养5d,取培养好的菌液用双层纱布过滤,除去菌丝,得到孢子悬浮液。用血球计数板记录孢子悬液孢子数,并将孢子悬浮液稀释不同浓度备用。

灭菌育苗基质采用欧博亚V 泥炭∶V 珍珠岩∶V 蛭石=6∶3∶1 混合物,高压消毒灭菌,装入40 孔穴盘备用。

1.2 接种方法试验

试验于2020 年10—12 月在河南现代农业研究开发基地育苗温室车间进行。采用4 种接种方法,分别为菌土接种法、胚根接种法、灌根接种法和下胚轴注射接种法。

菌土接种法[9]:选用灭菌基质与一定体积菌液量混合均匀,分装在40 孔穴盘中,平均每穴孔含菌液量10 mL,然后将催芽种子播于穴盘内。

胚根接种法:按翁祖信等[8]的方法进行,并稍作修改,即用孢子悬浮液浸泡催芽种子20 min,然后播于穴盘内。

灌根接种法:参照周红梅等[5]的方法,略有修改。种子催芽后,播于装有灭菌基质的40 孔穴盘中。子叶展平期,在距根际1 cm 处2 个方向各切1刀,以1 × 106 孢子·mL-1 浓度接种液灌根,每穴加入10 mL 孢子液。

下胚轴注射接种法:参照尤占武等[10]的方法,略有修改。种子催芽后,播于装有灭菌基质的40 孔穴盘中。子叶展平期,距离下胚轴1 cm 处,注射接种,接种量0.5 μL,浓度为1 × 106孢子·mL-1。

采用4 种接种法接种的黄瓜幼苗均随机置于育苗车间中,白天维持在24~30 ℃、夜间16~20 ℃培养。各处理均设3 次重复,每个重复30 盘。接种后3、8、13、18 d 观察黄瓜穴盘幼苗发病情况,调查各处理发病程度及病情指数。

1.3 接种浓度试验

利用筛选出的黄瓜枯萎病适宜接种方法,设枯萎病菌菌液接种浓度4 个梯度处理,分别为1×104、1×105、1×106、1×107孢子·mL-1。

1.4 病原菌摇菌时间接种试验

利用筛选出的黄瓜枯萎病适宜接种方法和接种浓度,进行病原菌生长时间接种试验。该菌株菌块接种在含有100 mL PDB 培养基的250 mL 的三角瓶中,25 ℃,250 r·min-1,分别振荡培养3、5、7、9 d,取培养好的菌液用双层纱布过滤,除去菌丝,得到孢子悬浮液。用血球计数板记录孢子悬液中孢子数,并将孢子悬浮液孢子浓度稀释至1×106孢子·mL-1,备用。

1.5 病情调查及分级

病害严重度分级标准:接种枯萎病菌后,黄瓜穴盘苗期发病症状主要表现有植株叶片黄化、植株枯萎、甚至整株枯死。根据症状特征,参考前人黄瓜枯萎病病级划分标准,建立黄瓜枯萎病0~4 分级标准(A 代表萎蔫面积)[11-12]。

0 级:叶片无症状;

1 级:叶片边缘或叶尖轻微褪绿变黄,黄化面积≤25%;

2 级:胚轴或子叶有明显坏死斑,叶片黄化或萎蔫面积25%

3 级:局部萎蔫,或子叶枯死,叶片重度黄化或萎蔫面积50%

4 级:整体萎蔫、倒伏或枯死,叶片完全枯萎。

接种后3、8、13、18 d 观察,调查各处理黄瓜穴盘幼苗发病情况,并记录病级数,计算各个处理病情指数:

病情指数(DI)= Σ(各级病株数×各级代表值)/(调查总株数×最高级代表值)。

抗性评价标准:参照司龙亭等[13]和陈振东等[14]按病情指数(DI)划分抗性评价标准,略有修改。

高抗(HR):0

抗(R):15

中抗(MR):35

感(S):55

高感(HS):75

1.6 防御酶活性和MDA含量测定

利用筛选出的黄瓜枯萎病适宜接种方法和最优接种浓度及病原菌最佳生长时间接种进行枯萎病胁迫下防御酶如苯丙氨酸解氨酶(PAL)、多酚氧化酶(PPO)、过氧化物酶(POD)活性和丙二醛(MDA)含量检测。于接种后筛选出的最优观察时间取样检测。MDA 含量采用硫代巴比妥酸法测定;参照刘新[15]的方法测定植物防御酶,分别以D290 nm、D470 nm、D410 nm 值变化0.01 为1 个PAL、PPO 和POD 酶活性单位。

1.7 数据统计与分析

利用Microsoft Excel 2016 软件进行图表制作,利用DPS7.05 等对数据进行处理与显著性分析。

2 结果与分析

2.1 接种方法对黄瓜穴盘幼苗枯萎病的影响

以病原菌1×106 孢子·mL-1 分生孢子浓度为原始接种量,利用下胚轴注射、菌土接种、灌根接种和胚根接种4 种接种方法对供试黄瓜材料进行枯萎病抗性试验。结果表明,随着接种时间延长,黄瓜枯萎病发病程度越严重、病情指数越高。当病原菌接种8 d 后,菌土法穴盘黄瓜幼苗枯萎病发病最轻,而下胚轴注射法黄瓜枯萎病发病快速整齐,病情指数较高,效果明显(表1)。两个感病品种博杰605和津研4 号病情指数分别高达60.6 和63.8,发病严重;而抗病品种博杰616 和博美310 病情指数分别为27.9 和29.4,由接种3 d 高抗降为一般抗性。与接种后13、18 d 比,病情指数差异显著,可以作为快速高效鉴定黄瓜枯萎病时间点。经过比较分析,下胚轴注射法、菌土接种法、灌根接种法及胚根接种法不同处理方法对穴盘黄瓜幼苗枯萎病发病效果影响依次为:下胚轴注射接种法>胚根接种法>灌根接种法>菌土接种法。

2.2 分生孢子接种浓度对黄瓜穴盘幼苗枯萎病的影响

采用下胚轴注射法,以1×104、1×105、1×106、1×107 孢子·mL-1 接种浓度对供试黄瓜穴盘幼苗子叶展开期进行枯萎病接种(表2)。结果表明,病原菌孢子不同浓度对黄瓜幼苗枯萎病发生均有一定影响,随着病原菌孢子浓度不断增加及接种后时间延长,黄瓜幼苗枯萎病发生越严重。各处理在接种后8 d 病情指数和接种后13、18 d 差异显著,可以作为快速高效鉴定黄瓜枯萎病时间点。当孢子接种浓度为1×106 、1×107 孢子·mL-1 时,黄瓜苗期枯萎病发生最严重,两者之间差异不明显,但明显高于孢子接种浓度1×104 和1×105 孢子·mL-1。因此,为了有效准确鉴定黄瓜资源抗病性,本试验确定黄瓜枯萎病病原菌孢子接种适宜浓度为1×106孢子·mL-1。

2.3 病原菌摇菌时间对黄瓜穴盘幼苗枯萎病的影响

采用下胚轴注射法,以病原菌摇菌时间3、5、7、9 d 分别配制1×106 孢子·mL-1 接种浓度,对供试黄瓜子叶展开期穴盘幼苗进行枯萎病接种(表3)。结果表明,病原菌摇菌时间对黄瓜幼苗枯萎病发生均有一定的影响。摇菌时间为3 d 和5 d 时,黄瓜苗期枯萎病发生较轻,两者之间差异不明显。随着病原菌摇菌时间增长,黄瓜幼苗枯萎病发生随之加重,摇菌时间为7 d 和9 d 时,枯萎病发病程度明显高于摇菌时间为3 d 和5 d 时。因此,为了有效准确鉴定黄瓜资源抗病性,本试验确定黄瓜枯萎病病原菌摇菌时间为7 d。

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