EMS处理对岷江蓝雪花种子萌发和幼苗生长的影响

［摘 要］ 为研究岷江蓝雪花新种质，获得新材料，丰富园林花卉资源，以我国本土特有康养型观赏植物岷江蓝雪花种子为供试材料，设置4个甲基磺酸乙酯（EMS）浓度处理梯度（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%）、4个浸种时间（1、3、5、7 h）进行诱变育种试验。结果表明，随着EMS溶液浓度增大和处理时间增加，岷江蓝雪花的发芽率和成苗率逐渐降低，植株矮化，冠幅变小；0.5%和1.0%浓度处理7 h以及1.5%处理3 h，获得的植株小型化最为显著，是进一步筛选发现突变体的重点群体。

［关键词］ 诱变育种；岷江蓝雪花；甲基磺酸乙酯；种子萌发

［中图分类号］ S567.19 ［文献标志码］ B ［文章编号］ 1674-7909（2022）16--3

0 引言

岷江蓝雪花（Ceratostigma willmottianum Stapf）为白花丹科（Plumbaginaceae）蓝雪花属（Ceratostigma Bunge）药用观赏植物［1］，花为少见蓝紫色，花期长（5—10月，部分地区为4—11月），生命力旺盛，适应性强，耐病虫害、耐寒，开发利用前景广阔。其药用和康养价值不可小觑。岷江蓝雪花作为一种药用植物，有治疗风湿病、跌打损伤、月经不调、气管炎和一定的镇痛抗炎等作用［2］；现代药理学证明，从其根部提取的白花丹醌等具有镇痛消炎、抗癌、抑菌等功效［3］。目前，除个别科研院所将其作为种质资源收集栽培外，该植物在我国几乎处于野生状态，因此，开展岷江蓝雪花新材料研究，对其商业化开发具有重要的意义。

甲基磺酸乙酯（Ethyl Methane Sulfonate，EMS）是一种应用广泛的化学诱变剂，可改变DNA的某些结构［4］，用其进行诱变育种具有简便易行、多效性、诱变范围广及突变频率高等优点。在作物育种研究中，EMS发挥了十分重要的作用，现已应用于植物、动物、真菌新材料研究领域［5-7］，如应用于蓝花丹、小麦、水稻、沙枣、油莎豆、花生、芸豆和白桦等植物新种质研究，同时在草鱼、啤酒酵母菌、烟酰胺生产菌等动物和微生物诱变上也有一定的应用。诱变后的植物在根长、株高、花色、叶形等方面发生了突变，出现根长缩短、植株矮化、花色变浅、叶片狭长等现象；菌类和动物诱变后出现发酵特性变好、酶活性提高现象；草鱼吻端组织细胞诱变后具有分裂增殖能力。

该项目以岷江蓝雪花种子为试验材料，以EMS为化学试剂，通过设置诱变剂不同浓度与处理时间，探索适于岷江蓝雪花的EMS诱变剂量，进一步研究岷江蓝雪花新种质，以获得新材料，丰富园林花卉资源。

1 试验材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为2020年采集于四川农业大学现代农业研发基地（成都市崇州市隆兴镇）的岷江蓝雪花种子。母株均为2年生实生苗，在盛花期6—10月人工随机异株授粉，12月底采收种子，清除杂物后将种子放入干燥器保存，次年6月用于此次研究。甲基磺酸乙酯（EMS）购于北京博奥拓达公司，用75%乙醇溶解EMS（体积比1∶1）后，加入pH值为7.2～7.4的0.01 mol/L磷酸缓冲液（PBS）定容，配制成2%EMS母液，再按比例稀释配制质量分数为0.5%、1.0%、1.5%、2.0%的EMS溶液备用。

1.2 试验方法

1.2.1 种子处理。种子经75%酒精灭菌0.5 min，用0.1%升汞灭菌8 min，用去离子水（RO水）冲洗后浸泡24 h，挑选吸胀饱满、完整的种子用于后续试验。采用完全随机试验设计，将预处理好的种子放入质量分数为0.5%、1.0%、1.5%、2.0%的EMS溶液中，RO水处理设为CK1，pH值为7.2～7.4的0.01 mol/LPBS（含乙醇）处理组设为CK2，恒温培养1 、3 、5 、7 h，共24个处理组合，每组60粒种子。处理完成后，用5%硫代硫酸钠解毒30 min，再以流水冲洗2 h。将冲洗后的种子均匀地铺在垫有两层滤纸的培养皿中，放入20～25 ℃培养箱中待种子发芽。将发芽种子移栽于泥炭土和珍珠岩配比为3∶1的穴盘中，置于20～25 ℃、光照140 μmol/（m2·s）、湿度80%培养箱中。待长出真叶后移栽至15 cm双色盆中，并放入苗圃统一管理。

1.2.2 种子发芽率与幼苗形态测定。

岷江蓝雪花种子播后90 d，用游标卡尺测量幼苗株高、冠幅，株高每株测定3次，冠幅分东西测量和南北测量，每个方向各3次。

2 结果与分析

2.1 EMS剂量效应方差分析

由表1、2、3可知，EMS浓度、浸种时间对各处理种子萌发率、株高及冠幅的影响是极显著的，致死和不同程度植株小型化是由EMS的剂量变化造成的。浓度与浸种时间存在显著的交互作用，可以进一步进行处理组之间的多重比较。

2.2 EMS处理对岷江蓝雪花种子发芽率的影响

由图1可知，与对照（CK1、CK2）相比，EMS抑制了种子萌发。处理时间7 h，EMS浓度为1.0%，发芽率约89.00%；浓度增加至1.5%，发芽率急剧下降至33.33%，浓度继续增加至2.0%，发芽率继续减少约5.00%，两浓度之间无显著差异。处理时间为5 h，1.5%浓度发芽率较1.0%显著下降，2.0%浓度时发芽率急剧降低至34.00%，此浓度下处理5 h与7 h之间差异不显著。CK1是RO水浸种，平均发芽率为92.76%，CK2是EMS溶液的溶剂浸种，发芽率为93.96%，二者几乎没有差异。同时可以发现，CK2组内岷江蓝雪花种子发芽率变化与处理时间没有规律，表明磷酸缓冲液作为溶剂对种子萌发有干扰，但对于岷江蓝雪花种子发芽率下降没有作用，各EMS处理组中种子萌发率下降主要是溶质EMS产生的效应。

2.3 EMS处理对幼苗株高的影响

由图2可知，与对照CK1平均株高231.67 mm相比，经EMS处理的幼苗明显矮化；但CK2的株高小于低剂量EMS处理的植株。随着EMS剂量（浓度与时间）增加，植株矮化越发明显。相同的处理时间下，EMS浓度越高，植株平均高度越低。2.0%浓度处理超过1 h，1.5%浓度处理超过3 h，种子虽然能萌发，但后期逐渐死亡，无法成苗。与CK1相比，2.0%EMS处理1 h植株平均高度下降超过30%，0.5%和1.0%浓度处理7 h平均株高下降约50%，1.5%浓度处理3 h平均株高下降至（81.40± 8.47） mm，仅为CK1株高的35%，这些差异均具有统计学意义（P＜0.05）。

2.4 EMS处理对幼苗冠幅的影响

由图3可知，与对照CK1平均冠幅149.70 mm相比，EMS处理的幼苗冠幅缩小10%～60%；CK2的冠幅小于CK1及低剂量EMS处理的植株。EMS剂量（浓度与时间）增加，冠幅缩减；2.0%浓度处理超过1 h，1.5%浓度处理超过3 h，种子虽然能萌发，但后期逐渐死亡，无法成苗。与CK1相比，2.0%EMS处理1 h植株平均冠幅下降32%，0.5%和1.0%浓度处理7 h平均冠幅下降约45%，1.5%处理3 h的平均冠幅最小，仅为CK1冠幅的42%，均达到了统计学意义显著差异（P＜0.05）。

3 结论与讨论

研究设置不同EMS浓度与处理时间，对岷江蓝雪花种子进行化学诱变处理。学界通常认为，半致死剂量可以取得存活率与诱变率的平衡。此次研究以发芽率作为判断半致死剂量的指标，1.5%EMS处理大于5 h小于7 h、2.0%EMS处理超过3 h小于5 h，可能是半致死剂量，但需要进一步设计更细致的试验予以证明。EMS处理通常会引起供试材料小型化，在外观上表现为株高变矮、冠幅变小、根系缩短等，这为突变体的初步筛选、减少鉴定工作量提供了便利，便于早期挑选潜在的变异植株。在此次研究中，EMS处理后植株高度和冠幅下降最大幅度达到65%和55%，2.0%EMS处理1 h、0.5%和1.0%浓度处理7 h以及1.5%浓度处理3 h，与半致死剂量基本重合，由此获得的植株小型化最为显著，是进一步筛选发现突变体的重点群体。半致死剂量可能是岷江蓝雪花种子的最佳诱变条件，为岷江蓝雪花进一步构建突变体库奠定了基础。

虽然研究观察到了M0代植株显著的形态变化，但是否为可遗传的稳定变异尚未可知，需要通过自交获得稳定的遗传群体，其中M2代为关键选育期，但岷江蓝雪花具有自交不亲和特性，自交结实率较低，为后代的鉴定带来巨大的障碍。因此，可以将M0代进行组织培养，继代3～5代后，对仍表现出小型化的植株通过分子标记或全基因组重测序。将诱变育种与组织培养技术相结合，既克服了岷江蓝雪花自交不亲和的障碍，也解决了木本植物获得稳定遗传时间较草本植物更长的难题。

参考文献：

［1］中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志［M］.北京：科学出版社，1987：9.

［2］李臻，白为，唐霄铧，等.药用观赏植物岷江蓝雪花（Ceratostigma willmottianum Stapf）研究现状［J］.安徽农业科学，2014（26）：8951-8953.

［3］张倩睿，吴方建.白花丹醌的药理学研究进展［J］.中国医院药学杂志，2016（36）：70-74.

［4］刘威，杨峰，任旭东，等.EMS对种子萌发影响的进展［J］.分子植物育种，2017（11）：4585-4589.

［5］WANI M R，KOZGAR M I，TOMLEKOVA N，et al.Mutation breeding：a novel technigue for genetic im-provement of pulse crops particularly chickpea （Cicer  arietinum L.）［J］.Improvement of Crops in the Era of Climatic Changes，2014：217-248.

［6］GALPAZ N，BURGER Y，LAVEE T，et al.Genetic and chemical characterization of an EMS induced mutation in Cucumis melo CRTISO gene［J］.Archives of Biochemistry and Biophysics，2013（2）：117-125.

［7］康富帅，颜兵，吕南拳，等.低嘌呤酿酒酵母的ARTP法诱变育种［J］.现代食品科技，2014（2）：188-191.