一株海洋来源的抑制淡水鱼类致病菌菌株的筛选与鉴定

［摘 要］ 随着淡水鱼类致病菌对抗生素耐药性的逐渐增强，抗生素残留、环境污染、水产品质量下降等诸多问题越发突出，急需寻找更有效的生物防治途径，遏制水域环境持续恶化、水产品质量持续下降的趋势。从江苏省连云港市黄海海域采集浅海的海泥与海草等样品，以奇异变形杆菌为指示菌，筛选出了能有效抑制其生长的有益菌株YZ1，抑菌圈直径为22.3 mm。对菌株YZ1进行生理生化鉴定和16S rDNA鉴定，利用NCBI网站对菌株YZ1的DNA序列进行BLAST比对，并构建系统进化树，发现菌株YZ1为海洋来源的解淀粉芽孢杆菌。试验结果为引入海洋来源微生物防治淡水鱼类致病菌、优化鱼类养殖环境提供了新的思路。

［关键词］ 枯草芽孢杆菌；海洋来源；奇异变形杆菌；抑菌性

［中图分类号］ Q939.10 ［文献标志码］ A ［文章编号］ 1674-7909（2022）18-88-3

0 引言

近年来，随着养殖科技水平的提升以及人们对水产品需求的增加，淡水养殖业得到了蓬勃发展［1-3］。然而，由于多年来人们一直片面追求产量而忽略质量，导致淡水养殖水体的水质不断下降，滋生出诸多淡水鱼类致病菌，严重影响淡水鱼养殖业的生产效益［4-5］。使用普通抗生素药物防治淡水鱼类致病菌会出现诸多问题，如致病菌耐药性增强、药物残留污染环境、水产品品质下降等［6］。因此，寻找到一种高效无污染的防治技术至关重要。

生物防治技术以无污染、成本低、作用时间长等优势，逐渐成为鱼类病害防治的热门技术。其中，海洋来源的微生物因其特殊的生境而具有耐高盐、耐高压、寡营养等强大的适应环境能力及良好的抑菌作用，被引入诸多生境中用于防治鱼类病害［7-9］。笔者从黄海海域采集浅海的海泥与海草等样品，从中筛选可抑制奇异变形杆菌的菌株，以期为防治淡水鱼类致病菌提供更多的理论依据。

1 试验材料与方法

1.1 试验样品

海泥与海草，采自江苏省连云港市黄海海域海岸线浅海地区；奇异变形杆菌，来自滁州学院生物与食品工程学院微生物实验室。

1.2 培养基

2216E培养基：蛋白胨5.0 g、酵母膏1.0 g、磷酸高铁0.1 g、琼脂15.0～20.0 g、蒸馏水1 000 mL，加热溶解后121 ℃高压灭菌15 min，待冷却至50 ℃倒入无菌平皿备用。

LB液体培养基：胰蛋白胨10.0 g、酵母提取物5.0 g、氯化钠10.0 g，蒸馏水定容至1 000 mL，pH值约为7.0。

1.3 试验方法

1.3.1 菌株的提取与分离。取少许海草与海泥放入试管，倒入10 mL蒸馏水，充分振荡；用移液枪吸取1 mL浑浊液滴在2216E培养基上，用灭过菌的涂布棒将浑浊液均匀涂布在培养基表面，放入37 ℃恒温培养箱中培养24 h；将培养基上长出的菌落根据形态分离纯化成单菌落，保存于4 ℃冰箱。

1.3.2 抑菌菌株的筛选。用灭过菌的接种环分别挑取分离出的单菌株及奇异变形杆菌少许菌丝，接种到LB液体培养基中，在180 r/min、37 ℃的恒温摇床中过夜培养；用移液枪吸取1 mL奇异变形杆菌的菌液滴到2216E培养基上，用灭过菌的涂布棒均匀涂开，而后在培养皿中放3张已灭过菌、直径6 mm的滤纸片，分别吸取分离出的单菌株菌液0.5 mL滴到各滤纸片上。将接种好的单菌株筛选培养皿放入37 ℃恒温培养箱中培养24 h，观察每个培养基中3个滤纸片周围有无抑菌圈，测量抑菌圈的直径，取平均值，保留具有明显抑菌圈、可抑制奇异变形杆菌的菌株。

1.3.3 抑菌菌株的生理生化鉴定。对筛选出的菌株进行形态观察，根据《常见细菌系统鉴定手册》进行革兰氏染色、淀粉水解、分解纤维素、硫化氢反应、过氧化氢反应、甲基红反应、乙酰甲基醇反应和吲哚反应等试验。

1.3.4 16S rDNA鉴定。取少量筛选到具有抑菌作用菌株的菌丝，接种到2216E培养液中37 ℃振荡过夜培养。根据DNA提取试剂盒推荐步骤，对菌株的DNA进行提取：移取2 mL菌液到EP管中，8 000 rpm/min离心2 min，取沉淀物。根据细菌16S rDNA两端的保守序列，设计细菌通用引物（滁州通用生物有限公司）为PCR扩增，引物序列27F：5＇-TACCTTGTTACGACTT-3＇，1492R：5＇-ATTAGATACCCTDGTAGTCC-3＇。反应条件：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性30 s，56 ℃退火1 min，72 ℃延长1.5 min；30个循环；最后72 ℃延伸5 min。

扩增后，对PCR产物进行电泳检测，取5 μL扩增样品在1%琼脂糖凝胶上、80 V电压下进行电泳检测，将条带清晰、大小正确的目的片段送至通用生物公司进行测序。

1.3.5 序列分析和数据处理。测序完成后，将所测细菌16S rRNA基因序列（大约1 500 bp），与在美国国家生物技术信息中心（National Center of Biotechnology Information，NCBI）数据库中选取的与这些菌株亲缘关系较近的相关标准菌16S rDNA基因序列，用BioEdit的多序列比对排列软件进行序列比对；用DNASTAR Lasergene软件建立Neighbour-Joining发育树。

2 试验结果与分析

2.1 抑菌菌株的筛选

笔者从海泥与海草中共分离出32株单菌株，利用奇异变形杆菌对分离出的菌株进行抑菌筛选，仅筛选出一株对奇异变形杆菌生长具有良好抑制作用的菌株，编号为YZ1。菌株YZ1单菌落为乳白色，圆形、全缘、半透明、湿润、易挑取，菌落直径1.0～1.5 mm，抑菌圈直径为22.3 mm。

2.2 菌株YZ1的生理生化鉴定

生理生化鉴定结果表示，菌株YZ1为革兰氏阳性菌，淀粉水解试验呈阳性，分解纤维素试验呈阴性，硫化氢反应呈阳性，在过氧化氢试验中出现气泡，甲基红试验呈阴性，乙酰甲基醇试验呈阳性，吲哚反应呈阴性（见表1）。

2.3 菌株YZ1的16S rDNA鉴定

提取菌株YZ1的DNA，通过PCR扩增目的片段，将目的片段进行测序，利用DNA Star软件分析目的片段的DNA序列，序列全长为1 429 bp（见图1）。

将目的片段的DNA序列在NCBI网站进行BLAST比对（见表2），其中近200株芽孢杆菌（Bacillus sp.）的DNA序列与目的片段的DNA序列相似性在99%以上。选择其中9株相似性较高的菌株序列，利用DNASTAR Lasergene软件构建系统进化树（见图3），发现菌株YZ1与解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens stain）M16.s的亲缘关系最为接近，结合菌株YZ1的生理生化鉴定结果及采样地点，证明菌株YZ1属于海洋来源的芽孢杆菌，暂将其命名为Bacillus sp.YZ1。

3 结论

因特殊的生境，海洋源微生物具有独特适应能力、代谢过程及生理功能，进而产生不同于陆地微生物的结构，以及新颖、功能独特的生物活性物质［8］，应用前景广泛。笔者通过对从海泥与海草中分离出的32株菌株进行抑菌试验，仅发现一株菌株可抑制奇异变形杆菌生长，编号为YZ1。笔者初步观察菌株YZ1的形态（乳白色，圆形、全缘、半透明、湿润、易挑取，菌落直径为1.0～1.5 mm）；并对菌株YZ1进行生理生化鉴定，发现其为革兰氏阳性菌，能水解淀粉，产生硫化氢气体，分解过氧化氢产生气泡，但不能分解纤维素和葡萄糖；通过16S rDNA鉴定，其与芽孢杆菌属在同一物种水平上，与解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens stain）的亲缘关系最近，初步认定菌株YZ1属于海洋来源的解淀粉芽孢杆菌。此结果为淡水鱼类病原菌的防治提供了一个可行途径，但其防治效果和防治机制还需要进一步的研究。

参考文献：

［1］吕超，汪翔，孙国锋.我国淡水养殖业生产布局的时空特征及变化趋势［J］.江苏农业科学，2017（15）：301-305.

［2］徐姣姣.长三角地区淡水养殖业空间集聚特征及影响因素［J］.农村经济与科技，2020（1）：77-79.

［3］周菊章.新时期淡水养殖业发展的空间变化探究［J］.产业与科技论坛，2019（3）：111-112.

［4］刘汝莲.淡水鱼春季常见疾病与防治［J］.养殖与饲料，2018（4）：79-81.

［5］周宁.浅谈春季水产养殖几种常见疾病［J］.科学养鱼，2018（3）：91.

［6］唐黎标.水产养殖环境的污染现状与控制对策［J］.渔业致富指南，2021（9）：12-15.

［7］邓德波.基于生态平衡视角的水产养殖池塘生物防治研究［J］.乡村科技，2018（14）：95-96.

［8］杨丹，穆军，李岩，等.一株种内拮抗的海洋枯草芽孢杆菌的分离与鉴定［J］.生物技术，2008（4）：40-43.

［9］黄潇航，陈志，陈欢，等.枯草芽孢杆菌在养殖业中的应用及展望［J］.畜牧兽医科技信息，2017（12）：8-9.