河北省土著鳜鱼种质资源鉴定

摘要：为探明河北省内的鳜属鱼类现状，更好地为全国鳜鱼种质资源保护提供可供参考的资料，以线粒体COX1和全基因组范围SNP标记为支撑对鳜属群体进行了分子水平的种质资源鉴定和遗传多样性水平相关分析。研究结果显示，获得40条全长为697 bp的COX1同源序列和SSH01、SSH02两个单倍型序列。最大似然法构建的系统发育树显示，两个单倍型先聚为一支，后又与斑鳜聚为一支。在地理种群系统发生树中，两个单倍型与参考的韩国Changju斑鳜聚为一支。群体的观测杂合度Ho均值为0.330，PIC均值为0.269，近交系数均值约为0，SSH01和SSH02在观测杂合度上差异不显著（P＞0.05）。群体中共祖系数为0的占总体的71.41%，存在较多亲缘关系近的个体。PCA分析结果发现，群体为可分为3个遗传结构，Cluster0、Cluster1、Cluster2；Admixture显示最有可能存在2个祖先；连锁不平衡分析的结果为，在95%置信区间下群体的Ne范围为14.8～27.6。河北省斑鳜存在两个单倍型，群体遗传多样性较低，与韩国Changju斑鳜有较高的亲缘性，可通过人为引种和增殖放流的方式保护好省内的鳜鱼种质资源。

关键词：斑鳜（Siniperca scherzeri）；线粒体COX1；SNP；遗传多样性

鳜鱼俗名桂花鱼，隶属于硬骨鱼纲（Osteichthyes），鲈形目（Perciformes），暖鲈科（Percichthyidae），鳜亚科（Siniperinae），是东亚地区特有的经济鱼类之一，在中国、日本、俄罗斯、朝鲜半岛等均有分布[1]。目前普遍认同的分布于我国境内的鳜鱼有鳜（S. chuatsi）、斑鳜（S. scherzeri）、大眼鳜（S. kneri）等。不同种类的鳜鱼在生长特性、繁殖能力、营养价值等方面存在差异。陈军等[2]发现同塘饲养下鳜的生长速度是大眼鳜的4～5倍，并且鳜卵巢发育的绝对怀卵量大于大眼鳜。宓国强等[3]发现斑鳜的肌肉蛋白质含量显著高于鳜。经过多年的选择培育、品种杂交，我国已培育出了多个鳜鱼新品种，如翘嘴鳜“华康1号”“秋浦杂交斑鳜”“长珠杂交鳜”等，在生长性能、抗病性能、适应能力等方面表现良好[4]。此外，我们积极通过分子选育手段开发与鳜鱼各种生长性状潜在相关的基因组区域和候选基因。2022年Zhou等[5]通过特定位点扩增片段测序和SNP基因分型，进行了全基因组关联研究（GWAS），在相关QTL内鉴定出65个与骨分化、生长和发育、细胞分裂和神经发生有关候选基因。

种质资源的多样性，不仅与改良生物性状，培育优质品种密切相关，还对研究物种起源、进化等理论有着极为重要的作用[6]。然而近年来，由于环境污染、竭泽而渔式的捕捞等原因，鳜鱼野生资源在逐步衰退。Yang等[7]的调查显示，鳜鱼是长江各水系的优势种之一。河北省拥有丰富的渔业资源，有104种淡水鱼类，包括鲫、乌鳢、鳜鱼、细鳞鱼等。河北省已建立了19个国家级水产种质资源保护区，其中位于安新县的白洋淀国家水产种质资源保护区和位于兴隆县和承德县境内的柳河特有鱼类国家级水产种质资源保护区都将鳜鱼作为主要保护对象[8]。

分子标记是研究鱼类遗传多样性的重要方法之一，鱼类常用的分子鉴定手段有Cytb、D-loop、线粒体12S rRNA等[9]。赵金良等[10]在细胞色素b基因序列的基础上，初步构建了东亚鳜类种间的系统发育关系，建议将长体鳜归入鳜鱼属，鳜类可分为鳜鱼群和少鳞鳜群两支；范世琦[11]利用筛选出的10对微卫星引物对重庆地区三个养殖场鳜群体的遗传结构和多态性进行了分析评价，发现三个鳜养殖群的香农威纳指数平均值在1.378～1427，群体遗传异质性较高；余科[12]利用线粒体DNA Cytb基因分析出了不同稻田鲤群体的遗传分化情况，发现从江等6个稻田鲤群体由欧洲鲤（Cyprinus carpio carpio）、远东鲤（C. carpio haematopterus）和华南鲤（C. carpio rubrofuscus）3个亚种组成；李龑[13]利用COI-Cytb-D-loop序列对鲤群体进行了遗传多样性分析，发现大头鲤、荷包红鲤抗寒品系和蓝鳞鲤之间的遗传分化较大。除此之外，近年来DNA条码技术也越来越受到人们关注，DNA条码指的是能够用来区分不同物种的，有一定标准的，并且足够变异的DNA片段[14]。于潇[15]利用PCR技术扩增出的线粒体cox 1基因，成功对50条软骨鱼类进行了鉴定，并验证了传统分类学中软骨鱼类的在目阶元上的分类。程汉良等[16]基于线粒体细胞色素c氧化酶亚基Ⅰ基因序列对帘蛤科贝类进行了系统发育研究，成功解决了帘蛤科传统分类上的难题。陈治等[17]使用12S和COI对145种常见海洋鱼类进行了鉴定，结果表明，COI对物种鉴定的准确率更高。线粒体DNA因其高拷贝的特点，也常被选为eDNA宏条形码的遗传标记，如12S、Cytb和COI[18]。Feng等[19]利用eDNA条形码来监测雅鲁藏布江中上游地区稀有和入侵鱼类的情况并对多样性进行了评估，其分析结果与传统的捕获法相印证。因此，为了解河北省内的鳜属鱼类现状，并探究其遗传多样性情况，我们利用线粒体COX1基因对鳜属鱼类进行了种质鉴定，并在全基因组范围SNP标记的基础上分析了其遗传结构和多样性，以期为鳜属鱼类资源保护和可持续发展提供参考。

1材料和方法

1.1材料来源

采集到的40尾鳜属鱼类，取自河北省承德市兴隆县柳河特有鱼类国家级水产种质资源保护区，如图1所示。每尾鱼在测量完基础生物数据后，取其背鳍后部1 cm长的鳍条，用95%乙醇固定保存，并存放在4 ℃的冰箱中用于DNA提取。

1.2DNA提取

待检样本DNA采用常规的酚-氯仿法提取，并通过1%浓度的琼脂糖凝胶电泳检测提取的样本DNA的完整性，部分结果如图2所示。

1.3PCR扩增

基于DNA条形码技术，以鳜属（Siniperca）鱼类线粒体基因组COX1基因5’端697 bp的一段序列作为种质鉴定的条形码序列，其扩增的上下游引物分别为：F primer：5′-TCGACCAATCACAAAGACATC-3′，R primer：5′-GGTGGCCAAAGAATCAGAAT-3′。PCR 反应体系总体积为 50 μL，其中 2×Taq PCR Master Mix 25 μL，上下游引物各 1.25 μL（5 μmol/L），DNA模板100 ng。PCR反应程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35 个循环；最后72 ℃延伸1 min。PCR产物采用上述的测序引物进行测通。

1.4数据分析

采用DNASP、Arlequin和MEGA软件，分析测通的40个待检鳜属样本序列，通过比对和单倍型分析，获得待检样本的全部单倍型。应用MEGA软件将上述单倍型与鳜属鱼类线粒体参考序列进行比对，并提取鳜属鱼类线粒体参考序列的目标单倍型序列。最后，通过MEGA构建系统发生树，结合系统发生树的拓扑关系和遗传距离，对待检样本开展基于分子生物学的种质鉴定。种质鉴定后，探究送检样本与我国不同地理区系鳜属鱼类在线粒体基因水平上的遗传变异关系。

基于全基因组范围SNP标记对送检样本开展种质遗传多样性及遗传结果分析工作，采用准确且具有高精度的高密度SNP标记对整个基因组进行评估，SNP过滤参数为maf=0.05，hwe=10-5，SiteMissingRatio=0，均匀度=20K。利用软件计算待检群体个体杂合度和近交系数。通过共祖系数分析群体内部个体之间的亲缘关系组成，利用派诺森云作图构建亲缘关系热图。通过主成分分析来探究群体遗传结构，通过Admixture软件估算40个样本的祖先组成情况，并利用Origin输出图像。基于对连锁不平衡参数LD值的无偏估计算法，对该种群以及线粒体单倍型亚群的有效群体的大小进行评估。

2结果与分析

2.1种质鉴定

使用引物扩增得到的目的条带单一清晰，符合标准。经过对待检样本PCR扩增产物测序（双向测通），获得40条全长为697 bp的目的片段，通过比对和单倍型分析在待检样本中共获得2个单倍型序列，分别为SinSample HB Hap01（简称SSH01）和SinSample HB Hap02（简称SSH02）。与此同时，以待检样本的2个单倍型序列、7个鳜属鱼类的8个单倍型序列和外群物种中国少鳞鳜，Coreoperca whiteheadi单体型序列，分别为SinSample HB Hap01，SinSample HB Hap02，Siniperca scherzeri DTH NC 015815.1，Siniperca oulei KP710957.1，Siniperca fortis NC 047290.1，Siniperca obscura EF143390.1，SinSample HLJ Hap01，Siniperca chuatsi NC015822.1，Siniperca knerii NC 015987.1，Siniperca undulata EF143393.1，Coreoperca whiteheadi KJ149811构建基于最大似然法的系统发生树，拓扑关系和遗传距离如图3所示。

通过系统发生树可以看出，7个鳜属参考物种先聚为一支，随后与同为鳜科鱼类的少鳞鳜属鱼类中国少鳞鳜（Coreoperca whiteheadi）聚为一支，该结果表明本研究采用的种质鉴定方法正确有效；待检样本的2个单倍型聚为一支，表明40个待检样本均为同一物种；随后待检样本与参考物种斑鳜（S. scherzeri）聚为一支，而且与常见的鳜属物种鳜（S. chuatsi）和大眼鳜（S. kneri）存在较大的遗传差异，表明待检样本为斑鳜（S. scherzeri）的可能性最大。

2.2不同地理种群系统发生分析

经过种质鉴定后，我们可在分子水平上判断送检样本为斑鳜（S. scherzeri）。斑鳜在我国分布广泛，北至鸭绿江水系、南至珠江水系，我国不同地理区系斑鳜在线粒体基因水平上也会有一些差异。为探清送检的斑鳜样本与我国不同地理区系斑鳜在线粒体基因水平上的遗传变异关系，收集了在公开数据库中发表的斑鳜线粒体COX1基因序列，包括分布在我国长江及长江以南水系的斑鳜线粒体COX1基因序列11条，来源于韩国Changju的斑鳜单倍型序列1条，以及外群物种（鳜）的2个序列，分别为Siniperca scherzeri ZJ02 OP050807.1，Siniperca scherzeri ZJ03 OP08431，Siniperca scherzeri ZJ01 OP0508031，Siniperca scherzeri XJ JQ0109881，Siniperca scherzeri ML01 MW6807251，Siniperca scherzeri ML02 MW6807581，Siniperca scherzeri DTH JQ010986.1，Siniperca scherzeri LiuJ MW680745.1，Siniperca scherzeri PYH JQ010985.1，Siniperca scherzeri CD EF1433911，Siniperca scherzeri LiJ JQ0109871，SinSample HB Hap02，SinSample HB Hap01，Siniperca scherzeri SK EF143392.1（韩国Changju斑鳜），Siniperca chuatsi NC 015822.1，SinSample HLJ Hap01。由于公开数据库中斑鳜线粒体COX1基因序列长短不一，所以经过比对和序列对齐后，提取到可用于下游分析线粒体单倍型的序列长度为647 bp。随后利用待检样本的2个单倍型序列、12个斑鳜不同地理区系单倍型序列以及外群物种（鳜）的2个序列，构建基于最大似然法的系统发生树，拓扑关系和遗传距离如图4所示。