急性低温胁迫对许氏平鲉鳃组织抗氧化能力和组织结构的影响

摘 要：为探究急性低温胁迫对许氏平鲉（Sebastes schlegelii）鳃抗氧化能力及组织结构的影响，以16 ℃为对照组，对许氏平鲉进行2 ℃急性低温处理，比较分析许氏平鲉在急性低温胁迫0 h、2 h、6 h和12 h后鳃组织中超氧化歧化物（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、总抗氧化水平（T-AOC）、丙二醛（MDA）的活性以及组织状态的变化。研究结果显示，许氏平鲉鳃组织中SOD随着胁迫时间的延长呈现先升高后降低的趋势，12 h时鳃组织中SOD活性显著低于对照组；CAT活性呈现先降低后升高的趋势；T-AOC与对照组相比明显降低；MDA活性趋势为先上升后下降。组织学分析表明急性低温胁迫下鳃组织出现了不同程度的损伤，例如鳃小片末端弯曲、肿胀、基部增生和缩短等现象。研究表明急性低温胁迫能够影响许氏平鲉鳃组织的抗氧化酶活性，造成氧化损伤，破坏鳃的组织结构。

关键词：许氏平鲉（Sebastes schlegelii）；急性低温胁迫；鳃；氧化应激；组织结构

水温是鱼类的非生物胁迫主要因素之一，对鱼类的生命活动调控造成影响，水温的降低会导致鱼类的机体产生氧化应激反应，同时在应激反应中会大量产生活性氧（Reactive oxygen species，ROS），导致细胞及机体受到严重的氧化损伤^[1]。在受到氧化损伤时，鱼类可通过激活抗氧化酶活性、释放神经递质和激素等生理过程，降低损伤程度^[2]，其中抗氧化酶活性在鱼体中的活性反映其是否参与机体的应激反应，因此特定酶的活性成为研究鱼类在低温下生理生化反应的重要标志物。鱼类有其特定的温度适应范围，在超过温度范围的急性低温胁迫下，鱼体的器官和组织都会呈现不同程度的损伤，甚至导致死亡，同时鳃的形状、结构在急性低温胁迫下也会发生不同程度的变化。

许氏平鲉（Sebastes schlegelii），又称黑鲪、黑头、黑鲉，属鲉形目（Scorpaeniformes），平鲉科（Sebastidae），平鲉属（Sebastes），为近岸暖温性底层鱼类，常栖息于水质清澈的岩礁区的泥沙底质水域近底层，无远距离洄游习性，不善集群，在我国主要分布在黄海、渤海和东海^[3]。许氏平鲉的最适生长水温为14～22 ℃，其肉质细嫩，味道鲜美，经济价值较高，而且繁殖能力强，能够适应不同的水域环境，是发展网箱养殖和人工放流的主要种类之一^[4]。目前关于低温胁迫对许氏平鲉的影响主要集中在性腺分化^[5]、肝脏代谢和血液指标^[6]等方面。在水体环境变化时，鳃组织能第一时间感知并向机体传递信号，与其他组织器官相比，鳃组织对水温的变化更敏感^[7]，因此阐明急性低温胁迫对许氏平鲉鳃组织的影响，对于揭示其响应机制具有重要意义。本研究测定许氏平鲉鳃组织在急性低温胁迫下的抗氧化能力指标，并观察鳃组织的形态变化，旨在探究许氏平鲉对急性低温胁迫的生理响应机制，为许氏平鲉的养殖提供一些参考数据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验用鱼来自大连天正实业有限公司同一批次繁育的许氏平鲉，选取外形完整且活力正常的鱼作为试验样品，随机选取60尾（平均体质量77.75 g±20.85 g、平均体长16.69 cm±3.12 cm）进行试验。在水温15 ℃，pH值7～8的条件下暂养一周，暂养期间，保证水中的溶氧在（7.0±0.2）mg/L。试验开始前24 h停止投喂，试验期间不投喂。

1.2 试验设计

试验开始前，用制冷机将试验水槽（1 000 L）中海水从室温匀速下降并恒定在2 ℃，取急性低温胁迫前的鱼作为对照组（12尾），试验开始后，将48尾鱼转移到水槽中，其他条件保持不变，分别在0 h（放入水槽后5 min）、2 h、6 h和12 h进行鱼体取样，每次随机选取12尾，对照组和各时间点命名分别为LTC、LT0、LT2、LT6和LT12。取样前，将各个时间点的试验鱼体放入MS-222的水溶液（200 mg/L）中快速麻醉，用滤纸擦净鱼体表水分后置于冰板上解剖，每个对照组和试验组取9尾鱼的鳃样品，快速液氮速冻，并转移至-80 ℃冰箱保存，用于酶活性分析，另外3尾鱼的鳃样品固定于4%的多聚甲醛中，用于组织学切片观察。

1.3 抗氧化指标测定

超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）活性、总抗氧化能力（T-AOC）和丙二醛（MDA）浓度均使用南京建成生物工程有限公司试剂盒测定。测定时，取鳃组织约0.4 g，按质量体积比1∶9加入0.9%的预冷生理盐水，将组织充分研磨制成10%的组织匀浆，使用离心机在4  ℃下2 500 r/min离心10 min，取上清液立即用于检测，使用多功能酶标仪检测吸光度。

1.4 组织学分析

许氏平鲉鳃组织在4%多聚甲醛中固定24 h后，取出组织，并使用去离子水冲洗掉固定液，随后用乙醇进行逐级脱水、二甲苯透明和石腊包埋处理，之后制成6 μm切片，采用苏木精-伊红（HE）染色，中性树脂封片，在OLYMPUS显微镜下观察并拍照记录。

2 结果

2.1 超氧化物歧化酶（SOD）活性

许氏平鲉鳃组织中SOD活性随着胁迫时间的延长呈现先上升后下降的趋势（图1），急性低温胁迫6 h之前，SOD活性无显著差异（P＞0.05），在胁迫24 h时鳃组织中SOD活性与对照组相比显著降低（P＜0.05）。

  不同字母表示不同处理组之间存在显著性差异（P＜0.05），下同。图1 急性低温胁迫对许氏平鲉鳃组织SOD活性的影响

2.2 过氧化氢酶（CAT）活性

许氏平鲉鳃组织中CAT随着胁迫时间的变化呈现先下降后上升的趋势（图2），其中LT0组活性最低，与对照组无显著差异（P＞0.05），急性低温胁迫2 h至12 h呈上升趋势，LT12组活性与其它组均存在显著差异（P＜0.05）。

2.3 总抗氧化能力（T-AOC）

许氏平鲉鳃组织中T-AOC随着胁迫时间的变化整体呈现下降的趋势（图3），在12 h时达到最低点，且与其它时间的总抗氧化能力存在显著差异（P＜0.05），LT0与对照组的T-AOC无显著差异，LT2和LT6与对照组相比显著下降（P＜0.05）。

2.4 丙二醛（MDA）含量

许氏平鲉鳃组织中MDA含量随着胁迫时间的延长呈现先上升后下降的趋势（图4），LT0、LT2和LT6组的MDA含量与对照组无显著差异，LT12的MDA含量最低，且与其它组均存在显著差异（P＜0.05）。

2.5 鳃组织结构变化

急性低温胁迫对许氏平鲉鳃组织结构的影响如图5所示，对照组许氏平鲉鳃组织未见组织学病变， 鳃丝结构完整，两侧鳃小片排列整齐有序，椭圆形的线粒体丰富细胞位于鳃小片底部和鳃丝连接处，着色较深，扁平上皮细胞和滤氯细胞排列紧密且规则。急性低温胁迫后0 h的鳃组织与对照组相比，有小部分鳃小片末端弯曲，其他无明显变化；在2 h后，部分鳃小片末端弯曲明显且有肿胀的现象；到6 h后，鳃小片末端弯曲和肿胀情况加深，且鳃小片的基部肿胀；在急性低温胁迫12 h后，上述情况更加显著，部分鳃小片出现缩短和消失的现象。结果表明，急性低温胁迫对许氏平鲉鳃组织的显微结构造成一定的损害。

3 讨论

3.1 急性低温胁迫对许氏平鲉鳃组织抗氧化酶活性的影响

动物正常的机体生理活动离不开自由基（ROS）^[8]，鱼类体内的ROS通常维持在一定水平范围内，急性低温胁迫会造成鱼体内ROS快速且大量累积，影响机体DNA、蛋白质和脂质的功能。鱼类含酶和非酶抗氧化防御系统可相互协调清除ROS，在急性低温胁迫中发挥着关键作用^[9]。

超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）作为具有抗氧化防御功能的重要酶，可有效清除活性氧，其动态变化可以准确地反映机体内ROS的代谢及组织的氧化损伤情况^[10]。在本试验中发现急性低温胁迫后12 h时鳃组织的SOD含量急剧下降，其原因可能是在低温环境中水体氧气溶解度增加或者线粒体流动性下降从而干扰了电子转移，导致其活性被过量的ROS抑制^[11]。这与军曹鱼幼鱼的鳃组织在低温处理后SOD显著降低的结果相似^[12]。而本试验中CAT的变化趋势与SOD相反，在急性低温胁迫后12 h时显著上升，在黑鲷（Acanthopagrus schlegelii）的研究也发现，低温胁迫后12 h内鱼体CAT活性显著上调，推测CAT的升高与急性低温胁迫后机体内ROS的大量累积有关，CAT活性逐渐升高以清除体内多余的ROS^[13]。

总抗氧化能力（T-AOC）是衡量体内各类抗氧化物质与抗氧化酶协同作用下展现出的综合抗氧化效能的指标，它有效反映了抗氧化系统功能的动态变化，对于全面评估机体抗氧化系统具有至关重要的价值^[14]。在急性低温胁迫2 h后鳃组织的T-AOC下降，且随着时间变化越来越显著，说明长时间的急性低温胁迫对鱼体的总抗氧化能力起到显著的抑制作用，这与史氏鲟（Acipenser schrencki）幼鱼^[15]的研究结果一致。

丙二醛（MDA）是ROS和细胞膜脂质发生过氧化作用的产物之一，它能加剧细胞膜的损伤，从而反映机体抗氧化能力的强弱^[16]。在本试验中，许氏平鲉鳃组织在急性低温胁迫下MDA呈先上升后下降的趋势，在2 h时达到最高点，说明低温会使鱼体内产生大量的脂质过氧化物，使机体受损，在6 h后MDA含量下降，说明鱼体内的抗氧化防御系统发挥一定作用。在对台湾泥鳅（Paramisgurnus dabryanus）的研究中，低温胁迫后MDA含量也呈先上升后下降的趋势^[17]，但在军曹鱼的低温试验中MDA含量随着时间逐渐增加^[12]，与本研究存在一定差别，这可能与物种、胁迫温度及胁迫时间等不同有关。

3.2 急性低温胁迫对许氏平鲉鳃组织结构的影响

鳃是鱼类气体交换、渗透压体调节和离子转运的重要器官，在适应水温变化以及调节自身生理反应等方面起重要作用^[18]，本研究中，许氏平鲉鳃组织在急性低温胁迫下出现鳃小片末端弯曲、肿胀、鳃小片增生、肥大、鳃丝肿胀和鳃小片缩短等形态变化，随着胁迫时间的延长，鳃组织发生的变化越来越明显，在2 h时出现鳃小片末端弯曲和肿胀的现象，在6 h更加严重，鳃小片明显增生和肥大，从一定程度上说明鳃组织发生了氧化损伤，可能由于急性低温胁迫后细胞膜上钠钾泵的功能受损，导致鳃小片发生水肿等现象^[19]，由于长时间处于低温环境，鱼体的自身调节能力受到限制，无法修复氧化损伤，在12 h时许氏平鲉鳃组织受损更为严重，鳃丝结构发现严重变化，导致鱼体的呼吸功能受到影响，甚至影响机体的存活^[20]。

4 结论

本试验研究表明，在急性低温胁迫下，许氏平鲉鳃组织的SOD、CAT、T-AOC和MDA均发生显著变化，抗氧化酶在机体受到损伤时发挥作用以清除体内过多的ROS，防止发生组织氧化损伤；鳃组织结构在急性低温胁迫下发生变化，且随着胁迫时间的增加，组织结构受损越来越严重，影响鱼体的正常生理活动，本研究为许氏平鲉的养殖提供一定的参考。