亚硝酸盐对鱼类的毒性效应研究进展

摘 要：亚硝酸盐是水产养殖中非常重要的水质指标之一，本文综述了环境因子对亚硝酸盐毒性的影响，亚硝酸盐在鱼体内的富集，亚硝酸盐对鱼类的生长发育、代谢、生殖、神经系统、组织结构、免疫功能以及抗氧化能力等方面的影响。

关键词：亚硝酸盐；毒性；鱼类

亚硝酸盐是水体中的氨氮转化为硝酸盐的中间产物，它是养殖水体中一种常见的污染物，是评判水体好坏的指标之一。亚硝酸盐是鱼类的强应激因子，当养殖水体中的粪便、残饵、藻类等含氮有机物增多时，鱼虾等水生动物可能会因为水体中缺氧或缺乏硝化细菌将含氮物质转化为硝酸盐，进而导致亚硝酸盐中毒，从而大量死亡。中国海洋生态环境状况公报显示， 2021年全国近岸海域水质为无机氮和活性磷酸盐超标，海洋天然重要渔业水域海水以及海水重点养殖区海水均存在无机氮超标现象［1］；内陆渔业水域的主要超标指标为总氮［2］。随着鱼类养殖规模化、集约化程度的不断提高，水环境的不断恶化导致养殖鱼类的病害问题日渐突出。养殖环境的恶化致使养殖鱼类处于各种环境胁迫之下，长期处于胁迫状态，严重时可导致死亡，给水产养殖业带来巨大的经济损失。本文从环境因子对亚硝酸盐毒性的影响、亚硝酸盐在鱼类体内的富集、亚硝酸盐对鱼类的毒性影响等方面影响进行综述，以期为水生动物健康养殖提供参考。

1 环境因子对亚硝酸盐毒性的影响

1.1 盐度

研究显示亚硝酸盐的毒性大小与水中盐度、溶氧量等因子直接相关。水中的Cl-可在一定程度上抑制鱼体内的亚硝酸盐吸收，且鱼对亚硝酸盐的耐受力也会在一定程度上升高［3］。韩枫等［4］发现随着水体中盐度的增加，花鲈（Lateolabrax maculatus）幼鱼对亚硝盐氮的96 h LC50的浓度由16.357 mg/L增加至58.622 mg/L；不过另有研究发现佛罗里达鲳鲹（Trachinotus marginatus）在水体盐度为5‰以及30‰时亚硝酸盐的半数致死浓度相似［5］。说明适当提高水体盐度可以有效降低亚硝酸盐的毒性，而盐度过高或过低均会提高亚硝酸盐的毒性。

1.2 溶解氧

水环境中高浓度的溶解氧可以影响进入鱼体内亚硝酸盐的含量，增强鱼类对亚硝酸盐的耐受力，而低溶解氧、高亚硝酸盐时机体存在氧化应激［6］。相同规格的大菱鲆（Scophthalmus maximus）在正常溶氧下96 h LC50为130.66 mg/L，而在饱和氧气情况下其96 h LC50上升到了390.78 mg/L［7］。急性缺氧会增加白斑角鲨（Squalus acanthias）血浆中的亚硝酸盐含量［8］。不过在缺氧状态下褐鳟（Salmo trutta）血浆以及心脏组织中亚硝酸盐的含量同正常溶氧下的含量无显著差异，而肌肉中的亚硝酸盐含量显著高于正常溶氧状态下，且缺氧状态下血浆中的硝酸盐含量比正常溶氧状态下高，研究者认为可能是机体本身的内部代谢或解毒将亚硝酸盐转化为硝酸盐，故其推测缺氧状态下鱼类亚硝酸盐的摄取率高于正常溶氧状态［9］。

1.3 温度

鲤在20 ℃下其组织中的亚硝酸盐含量显著高于14 ℃，且两个温度下血浆中的亚硝酸盐浓度高于实际环境3.5～7倍之多［10］，笔者认为这是由于鲤是变温动物，升温导致其新陈代谢速率上升，也就增加了亚硝酸盐在体内的富集。温度同时也会影响到水生动物对亚硝酸盐的耐受力，随着温度的降低，鱼类对亚硝酸盐的耐受力增加，大西洋白姑鱼（Argyrosomus regius）在18、22 ℃及26 ℃下亚硝酸盐的96 h LC50分别为177.6、139.5 mg/L和49.61 mg/L［11］，研究表明当水体温度高于30 ℃时，暴露于亚硝酸盐中有助于促进铠甲弓背鱼（Chitala ornata）的生长，但其存活率显著降低［12］。

2 亚硝酸盐在鱼类体内的富集

研究发现水体中亚硝酸盐主要以亚硝酸盐离子（NO-2）及亚硝酸（HNO2）两种形式存在，NO-2主要通过鳃部的氯细胞吸收进入动物体内，HNO2主要通过鳃膜自由扩散进入动物体内［13］。亚硝酸盐能够在不同鱼类体内积累，由于暴露时间及浓度、鱼的种类以及水环境的不同，而有所差异，在血浆中可以累积较高水平的亚硝酸盐，同时在肝脏、心脏、大脑、肌肉、鳃及鼻等组织中也可以累积一定量的亚硝酸盐。鱼类中海水鱼与淡水鱼类吸收亚硝酸盐的方式存在差异，淡水鱼类对于水环境存在高渗性，而海水鱼类对于环境则具有低渗性，海水鱼类主要通过肠上皮吸收亚硝酸盐，淡水鱼类则主要通过鳃吸收亚硝酸盐［14］。

亚硝酸盐主要通过与氯化物竞争吸收位点，跨过鳃的屏障，并在鱼类血液中大量蓄积，由于其与氯化物的竞争使得高氯化物吸收率的鱼类对其较为敏感。不过并不是所有的鱼类都会在体内蓄积超过环境浓度的亚硝酸盐，斑马鱼（Danio rerio）以及黑带娇丽鱼（Amatitlania nigrofasciata）在亚硝酸盐暴露后其血液中亚硝酸盐的含量显著低于环境浓度，值得关注的是，对照组的斑马鱼血液中的亚硝酸盐浓度高于暴露组的黑带娇丽鱼10倍之多［15］。此外，还有研究指出部分鱼类可以通过呼吸空气获得氧，在亚硝酸盐暴露下其可能通过减少水呼吸增加空气呼吸来减少亚硝酸盐的吸收，增强对亚硝酸盐的耐受力，比如线鳢（Channa striata）在亚硝酸盐暴露后血浆中的亚硝酸盐浓度虽有所上升，但低于水体中的浓度［16］。

3 亚硝酸盐对鱼类的毒性影响

3.1 亚硝酸盐对鱼类生长发育和代谢的影响

研究显示，一定浓度亚硝酸盐暴露会影响鱼类的生长发育。随着亚硝酸盐暴露浓度的增加，斑马鱼胚胎中的死亡细胞数明显增多，在最高处理组（2 mg/L）出现胚胎死亡现象，同时研究者观察到暴露组的胚胎出现心包水肿、脊柱弯曲、头部卵黄不同程度发黑等畸形现象，且部分胚胎发育迟缓［17］。在亚硝酸盐（mg/L N）暴露浓度达到30 mg/L时稀有鮈鲫（Gobiocypris rarus）胚胎开始出现畸形现象，随着暴露浓度增加其畸形率显著上升，并在101.25 mg/L时出现一定死亡现象，且鱼体和鱼鳔的长度显著低于对照组［18］。

大西洋鳕（Gadus morhua）暴露在不同浓度的亚硝酸盐中饲养96 d，研究人员发现32 d时高浓度组鱼的平均体重显著低于其他组，而63 d以及96 d时所有处理组的平均体重均低于空白组的体重［19］。在300 mg/L NaNO2中暴露7 d后海鲈（Lateolabrax japonicus）生长代谢相关基因谷氨酰胺合成酶（gs）、瘦素（lep）在不同组织中表现出上调，谷氨酸脱氢酶（gdh）则在鳃组织中表现出上调，在脾脏中则表现出先上调后下调现象［20］。GS和GDH是氮代谢中的关键酶，二者协同降解无机氮，对维持机体氮水平起关键作用。在亚硝酸盐暴露后，鱼为了适应渗透环境的变化，lep表达上调，促进代谢，用以维持提高新陈代谢所带来的能量消耗 。黑带娇丽鱼及斑马鱼在亚硝酸盐暴露后肌肉中精氨酸酶的活性显著增加，同时血浆中尿素的水平显著上升，尿素排泄也相应提高［15］。急性亚硝酸盐暴露后鱼类血清中的葡萄糖、皮质醇（COR）、甘油三酯（TG）以及总胆固醇（TC）水平会呈现不同程度变化。；团头鲂（Megalobrama amblycephala）在亚硝酸盐暴露后其血清中COR、葡萄糖水平显著上升，但其在20 mg/L暴露12 h后TC的浓度显著低于对照组，随着暴露时间的推移，其呈现上升趋势，乳酸脱氢酶（LDH）活性显著增加［21］。COR的增加会导致机体对葡萄糖的利用降低，增强肝脏糖异生，导致血糖浓度上升，TC以及TG是鱼类脂质代谢的重要物质，研究者认为TC的下降是由于在暴露的初期，鱼体为了抵抗亚硝酸盐而过度消耗能量，导致TC下降；而随着时间的推移，鱼的新陈代谢补偿机制被激活，使得TC平上升，以抵抗后续亚硝酸盐暴露。LDH是鱼类葡萄糖厌氧代谢的关键酶，其活性的增加表明鱼类需通过增强厌氧代谢以获取能量，露斯塔野鲮（Labeo rohita）在亚硝酸盐长期暴露后LDH活性显著上升，证实这一观点［22］。研究显示，长期的亚硝酸盐暴露后，翘嘴鳜（Siniperca chuatsi）血浆中葡萄糖、TG以及TC水平显著低于对照组，全鱼以及肝脏和肌肉组织中的蛋白质含量显著降低，同时血尿素氮以及乳酸盐有所增加，这是由于在长期胁迫下，鱼类需要稳定的能量来应对环境压力，导致鱼类需要分解体内更多的营养代谢物，促进蛋白质代谢以及增强厌氧糖酵解来获得能量，继而导致生长性能下降［23］。

3.2 亚硝酸盐对鱼类生殖的影响

亚硝酸盐暴露会诱导露斯塔野鲮幼鱼的性类固醇（睾酮和雌二醇）和甲状腺激素（T3、T4）水平显著降低［24］。此外，亚硝酸盐暴露导致斑马鱼下丘脑-垂体-性腺-肝轴（HPGL轴）中相关基因，如脑中的促性腺激素释放激素（gnrh）、黄体生成素（lhβ）、脑芳香化酶（cyp19a1b），精巢中的雄激素受体（ar）、卵泡刺激素受体（fshr）、促黄体激素受体（lhr），卵巢中的芳香化酶（cyp19a1a）等显著下降，表明亚硝酸盐可以通过减少HPGL轴相关基因的转录水平来下调鱼类的睾酮和雌二醇水平，引起生殖毒性；同时亚硝酸盐暴露显著抑制了鱼的体重、性腺重量以及性腺指数，精巢中部分小管的细胞密度显著下降，且支持细胞（Sertoli cells）在组织和超微结构中的残留体增加，表明亚硝酸盐暴露会破坏精子的生成，导致严重的生长抑制和性腺损伤［25］。

3.3 亚硝酸盐对鱼类神经系统的影响

亚硝酸盐暴露会抑制鱼类的多巴胺（DA）、乙酰胆碱酯酶（AchE）、γ-氨基丁酸（GABA）等多种神经递质。AchE及组织DA被认为是评估神经毒性的生物标志物［26］，AchE主要起到催化乙酰胆碱水解的作用，乙酰胆碱（Ach）是一种可唤醒神经肌肉接头和中枢神经系统的信号分子。Yang等［27］报告称，在亚硝酸盐暴露下的斑马鱼脑部观察到线粒体液泡变性以及神经元轴突末端及脑部的DA含量、AchE活性以及ache表达水平降低，同时发现与鱼类神经纤维髓鞘化相关基因髓鞘碱性蛋白（mbp）和脑源性神经营养因子（bdnf）以及DA合成途径中的限速酶酪氨酸羟化酶（th）的基因表达水平下降，推测亚硝酸盐有可能为胆碱酯酶的抑制剂，通过抑制胆碱酯酶的活性阻碍神经传导的正常进行，同时其有可能通过抑制th的表达来损害多巴胺能神经系统。

3.4 亚硝酸盐对鱼类组织结构的影响

鳃、肝脏及肾脏组织对鱼类抵抗环境毒性有着至关重要的作用，鳃组织与水环境大面积接触，使得其极易受水环境的影响；肝脏及肾脏则是鱼类重要的解毒器官。鳜鱼在亚硝酸盐暴露后鳃丝出现明显弯曲、变形以及肿胀现象，肝脏组织出现明显的炎症细胞浸润现象［28］。亚硝酸盐暴露还会改变鱼类血液参数，如：血细胞比容降低、血红蛋白含量降低以及离子紊乱。Martinez等［29］报告称，高身丽脂鲤（Astyanax altiparanae）以及条纹鲮脂鲤（Prochilodus lineatus）在亚硝酸盐暴露2 min后，其红细胞体积出现不同程度的收缩现象，认为这是由于亚硝酸盐进入细胞后导致甲基红蛋白形成以及K+外流，继而导致红细胞收缩以及细胞外高钾血症。

3.5 亚硝酸盐对鱼类免疫功能的影响

亚硝酸盐可以通过控制白细胞介素（ILs）以及肿瘤坏死因子（TNFs）等细胞因子来影响鱼类机体免疫反应，亚硝酸盐暴露后红鳍东方鲀鳃组织中tnf-α、il-6、il-12以及B细胞活化因子（baff）的表达水平显著上升，同时血浆中血清总蛋白以及白蛋白的含量显著下降，溶菌酶活性在胁迫开始24 h后出现下降趋势［30］，而tnf-α、il-6以及il-12均参与细胞炎症免疫应答，表明亚硝酸盐暴露触发了细胞炎症反应。同时Xie等［31］观察到草鱼肝细胞在亚硝酸盐暴露后，内质网应激标志物基因葡萄糖调节蛋白78（grp78）的表达显著上调，同时蛋白激酶R样内质网激酶（perk）、真核生物起始因子2α（eif-2α）、转录激活子4（atf4）以及CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白（chop）基因出现上调，抑制基因B淋巴细胞瘤-2基因（bcl-2）的表达显著下调，促凋亡基因细胞凋亡调控蛋白Bcl-2相关X蛋白（bax）表达显著上升，细胞的活力下降、凋亡率上升，表明亚硝酸盐暴露诱导内质网应激及细胞凋亡。