不同水平包膜丁酸钠对刺参（Apostichopus ja-ponicus）生长性能、消化酶活性、非特异性免疫和抗病力的影响

关键词：刺参（A postichopus ja Ponicus）；包膜丁酸钠；肠道消化；非特异性免疫

刺参（Apostichopus japponicus），因其丰富的营养价值成为我国北方地区重要的水产养殖品种之一。近二十年来，随着人民生活水平不断提高，刺参的市场需求也不断扩大，刺参养殖业也得以快速发展起来。但随着集约化养殖方式的不断扩大，刺参免疫力下降、病害频发等问题日益严重。同时，传统使用的抗生素被国内国际官方机构列入禁用清单，因此，探求更高效、更安全的新型饲料添加剂尤为重要。

丁酸具有维持机体肠道上皮细胞正常形态、调整菌群微生态平衡、促进损伤修复的特性。通过在饲料中加入适量丁酸，可以提高饲料酸度，进而降低机体肠道内的pH值大小，从而有效地促进胃肠道消化酶分泌，继而起到促进生长、提高机体免疫力的作用。本文选取丁酸钠作为添加物，但由于丁酸钠具有特殊气味和不稳定的化学特性，为便于饲料加工和刺参采食，试验采用生物包被技术制备而成的包膜丁酸钠（MSB），以减少流失等产生的试验误差。目前，在饲料中添加丁酸钠的研究主要集中在畜禽养殖生产方面，如仔猪、荷斯坦牛、蛋鸡等，在水产动物的报道集中在鱼类品种，在刺参饲料中添加丁酸钠的相关研究鲜有报道。因此，本试验旨在通过刺参饲料中添加不同水平包膜丁酸钠，分别测定各组刺参的特定生长率、消化酶活性、肠道生长状况和免疫酶活性等指标，以探究丁酸钠在刺参饲料之中添加效果和适宜的添加水平，为包膜丁酸钠在水产一线的推广及应用提供理论依据。

1材料与方法

1.1试验设计与饲养管理

本试验在山东省威海市荣成市好当家集团有限公司南海育苗基地苗种研究所的养殖实验车间开展。试验设计五个处理组、一个对照组，每个处理组3个重复（整个试验共计18个处理），每个处理组分别投喂相应水平梯度试验饲料。

所有试验用刺参首先要经过7d暂养以适应环境温度和饲料。暂养期间水质条件：水温（16.0±0.5）℃，溶氧>9.6 mg/L，氨氮水平<0.05 mg/L。暂养饲料使用配置的基础饲料。暂养结束以后，所有刺参禁食24 h。驯化结束后，选取大小相仿、健康活跃、状态优良、质量均匀的刺参360头，随机分配于18个0. 70 m×0.50 m×0.50 m养殖箱（养殖容积约为180L）中。养殖周期为60 d，期间昼夜不断，持续冲氧，水温（16±0.5）℃，盐度30‰左右，溶氧度>9.98 mg/L，pH值7.6～8.2；每天上午10点准时换水1／3，下午3点准时投喂一次，并控制投喂量为刺参体重的5%。

1.2饲料配方和制备

从饲料生产车间选取适当的饲料原料，设计试验基础饲料配方如表1。

在基础饲料上添加不同水平（1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 g/kg）的包膜丁酸钠（由青岛百美佳生物科技有限公司提供，有效包膜丁酸钠成分为74.13%），同时设置0 g/kg为对照组。同时以微量纤维素作为饲料添加剂调节组分（微量纤维素不具有功能性饲料添加剂的功能）。

将饲料原料依据品目分别粉碎过100目筛，得到的微量成分采取逐级扩大的试验配方的比例定量混合均匀，放人V型搅拌机中充分混合30 min。加水混匀，经颗粒饲料机制成直径为2.5mm的硬颗粒，将得到的颗粒饲料用烘干机在40℃条件下烘干至饲料水分含量10%左右，放在双层封袋之中，放置于在- 20℃冰箱中保存。

1.3样品采集与处理

试验结束后，将各组刺参禁食24 h，再进行各组分的采样和分析。

1.3.1生化样品的采集 每个水箱随机选取10头刺参，用解剖剪将腹面剪开，取出呼吸树、肠道，用生理盐水冲洗以去除其中的食物残渣，用定性滤纸擦净后置于1.5mL离心管中。用无菌注射器采集体腔液后装入1.5 mL离心管内，迅速将取得的样品放人液氮速冻后，于－80℃条件下保存，用于消化酶活性和非特异性免疫活性酶的测算。每个水族箱内刺参全部采集混合后作为一个重复样本，紧接着进行体成分的采集。

1.3.2体成分采集与测定 将取完生化样品的刺参腹面完全剪开以去除剩余的体腔液，在相同部位取一块体壁（lg左右），置于1.5 mL离心管中。剩余体壁冷冻保存以备常规成分及氨基酸分析等测定使用。试验所用玻璃器皿和解剖工具均在180℃灼烧5h以去除RNAase后进行操作。

1.3.3生化样品处理 分别选取每个样品中的0. 3～0.5 g体壁或肠道样品，剪碎，加入4倍体积的冰冷生理盐水（0.86%），制成20%匀浆，在4℃条件下10000 g离心20 min，取出上清液分装待测。体腔液样品则先置于4℃冰箱中解冻后，再用超声波粉碎仪进行细胞破碎，然后4℃条件下376 g离心10 min，收集上清体腔液及底层体腔细胞分装待测。

1.4生长指标的测定与计算

试验开始和结束，分别对养殖箱内的刺参逐个进行称重并计数，再根据下列公式计算刺参相关生长指标。

1.5消化酶的测定

冷冻样品在冰上解冻，并用0.9%生理盐水进行匀浆。将得到的匀浆液在4℃，10000 g条件下，进行20 min离心操作。静置后取得上层清液进行酶活性测定，所有匀浆液样品4℃下保存并在24 h内测定。蛋白酶活力采用福林酚方法测定，淀粉酶及脂肪酶活力采用南京建成生物工程研究所试剂盒测定。严格参照操作说明，保证所有待处理样品在24 h内测定完毕。

1.6非特异性免疫酶活性的测定

把冷冻样品在冰上解冻，在4℃，3000 g条件下离心20 min。上清液转移到1.5 mL离心管中，4℃条件下保存，选取超氧化物歧化物酶（SOD）活性、过氧化氢酶（CAT）活性、溶酶菌（LSZ）活性、碱性磷酸酶（AKP）和酸性磷酸酶（ACP）活性为本试验非特异性免疫酶活性的指标，采用南京建成生物工程有限公司的试剂盒进行测定，严格参照操作说明，保证所有待处理样品在24 h内测定完毕。

1.7攻毒试验

1.7.1制备菌悬液 将致病菌灿烂弧菌（Vibri-os Pzendidu）置于37℃下培养48 h，得到的细菌液用5 mL灭菌海水进行洗菌冲洗，制成细菌悬液，取l mL经过不同的梯度稀释后用血球计数板计数，最后调整至1扩10⁹ CFU／mL。

1.7.2攻毒试验 在60 d养殖试验结束后，对所有取样后的剩余刺参个体，依次注射浓度为109 CFU／mL V. Pzendidu菌液0.5 mL进行攻毒试验，水温控制在16℃。将刺参放回原试验水箱，保持连续不断通氧养殖，持续时间为15 d。攻毒期间其它养殖条件不变，不进行饲料投喂，每日观察并记录刺参的死亡情况，最后统计死亡率。

1.8数据统计分析与记录

通过SPSS 22.0软件进行试验数据统计分析。所有数据在满足方差齐性和正太分布检验后，进行单因素方差分析和Tukey’s多重比较分析，显著性水平为P<0.05。数据以平均值±标准误差（Mean±S.E.M）来表示。

2试验结果

2.1对刺参生长性能的影响

不同水平的包膜丁酸钠（ MSB）对刺参生长性能的影响见表2。随着饲料中MSB添加量的增加，刺参的增重率和特定生长率出现先提高后降低的趋势，在MSB添加水平为3.0 g/kg时达到最大，显著高于对照组（P<0.05），但与2.0 g/kg组差异不显著（P>0.05）；MSB添加水平为1.0、4.0、5.0 g/kg时刺参增重率和特定生长率与对照组差异不显著（P>0.05）。对于脏壁比，在饲料中添加MSB水平为2.0、3.0 g/kg时的刺参脏壁比显著低于对照组（P<0.05），而当MSB添加水平为1.0、4.0、5.0 g/kg刺参的脏壁比与对照组差异不显著（P>0.05）。

如图1所示，对于饲料系数，在饲料中添加MSB对刺参饲料系数的影响呈现先降低后增高的趋势，添加水平为2.0 g/kg时刺参饲料系数达到最低，显著低于试验组（P<0.05），与添加水平为3.0 g/kg时不具有差异性（P>0.05）。

2.2对刺参肠道消化酶活性的影响

如图2所示，MSB在饲料中添加不同水平而对刺参消化道中消化酶的活性影响不同。对于蛋白酶，饲料中添加不同水平MSB均不同程度地提高了刺参蛋白酶活性；添加水平2.0 g/kg时刺参的蛋白酶活性最高，显著高于对照组（P<0.05）；包膜丁酸钠（MSB）添加水平为1.0、5.0 g/kg时与对照组之间差异不显著（P>0.05）。对于淀粉酶，MSB添加水平为2.0、3.0、5.0g/kg的淀粉酶活性显著高于对照组（P<0.05），而彼此之间不具有统计学上的差异（P>0.05）。对于脂肪酶，MSB添加水平为3.0 g/kg时，刺参的脂肪酶活性最高，显著高于对照组（P<0.05）；MSB添加水平为1.0 g/kg时脂肪酶活性与对照组差异不显著（P>0.05）。

2.3对刺参非特异性免疫酶活性的影响

在饲料中添加不同水平的MSB对刺参免疫酶活性的影响见图3，随着饲料中的MSB添加水平的提高，刺参SOD活性呈现出逐渐升高后又下降的趋势，总体较对照组均有不同程度的提高，其中在添加水平为3.0 g/kg时达到最高，显著高于对照组（P<0.05）。MSB添加水平为2.0 g/kg时过氧化氢酶活性为最高，显著高于对照组（P<0. 05）。随着MSB的添加水平提高，刺参溶菌酶活性呈现期初略微下降，待添加水平超过2.0 g/kg后开始提高的趋势，当添加水平提升到4.0 g/kg时，溶菌酶的活性抵达峰值并且显著高于对照组（P<0.05）。饲料中添加不同水平MSB刺参的碱性磷酸酶（AKP）和酸性磷酸酶（ACP）活性呈现先提高后下降的趋势。

2.4对刺参抗病力的影响

泼洒灿烂弧菌（Vibrios Pzendidu）后，被感染的刺参摄食量下降，体色变浅发白，体壁发软，体表腐皮增多直至最后死亡。图4显示为刺参的累计死亡率，除对照组和添加包膜丁酸钠（ MSB）水平为1.0g/kg组从第一天开始出现化苗，其余处理组均从泼洒后的第二天开始死苗。在整个攻毒周期内，对照组的刺参死亡率始终高于试验组，在第9天达到了稳定的69.0%；添加水平为4.0g/kg时刺参累计死亡离从第5天起开始显著低于其他的试验组，在第8天达到稳定的35.67%，显著低于对照组（P<0.05）；添加水平为5.0g/kg时，前期的死亡率得到有效控制，处于较低值，在第4天骤然上升，最后稳定在了57.33%，与对照组差异不显著（P>0.05）。添加水平在2.0g/kg时较其他试验组相比，最早达到稳定的44.67%，与对照组差异显著（P<0.05）。

3讨论

3.1对刺参生长性能的影响

丁酸钠具有提高动物生长性能的作用，在畜禽、水生动物养殖生产过程中都有了一定的研究报道。在畜禽方面，徐振飞等发现肉仔鸡配合

日粮中添加300 mg/kg包膜丁酸钠能显著提高肉仔鸡生产性能；在水产动物上，杨良辉等发现添加丁酸钠是保障罗非鱼良好生产性能的首选；张淞林等发现饲料中添加1.0‰的丁酸钠，美洲鳗鲡增重率提高了37%，饲料系数降低了26%；孙浪等发现在饲料中丁酸钠添加量为2.5 g/kg时，鲫鱼增重率、特定生长率、蛋白质效率和肥满度分别提高了25.76%、16. 46%、28.91%和8.37%。本试验结果与上述报道相类似，在饲料中添加一定剂量的包膜丁酸钠可以促刺参生长，随着丁酸钠添加量的增加，不同处理组刺参的增重率、特定生长率有先增后减的趋势，添加水平为3.0 g/kg丁酸钠处理组刺参的增重率、特定生长率达到最大，显著高于对照组（P<0.05），此时饲料系数为最低，此时的生长和营养利用效率最高。但当丁酸钠高于3.0 g/kg时刺参的生长情况逐渐变差，这可能与其抑制了刺参的肠道发育水平和降低了刺参对营养物质的消化吸收率有关，不再具有诱导刺参生长的作用。