拟穴青蟹STEAP4-like基因的克隆与表达分析

关键词：拟穴青蟹（Scylla paramamosain）；前列腺6跨膜上皮抗原4;基因克隆；基因表达；白斑综合征病毒

中图分类号：Q78

拟穴青蟹（Scylla paramamosain）为梭子蟹科、青蟹属，是一种重要的经济养殖蟹类，广泛分布于中国和印度一西太平洋沿岸。然而随着海水养殖业的快速发展，与集约化水产养殖方式的出现，青蟹感染病原微生物的机率也大大增加。呼肠孤病毒（Reovirus）、双顺反子病毒（Bicistron-ic virus）、白斑综合征病毒（white spot syndromevlrus，WSSV）等病毒感染引起的病毒性疾病是引起青蟹病害的重要原因，严重制约了青蟹养殖业的健康发展。其中，WSSV是海洋动物常见的致病性病毒，可以感染绝大多数的海洋甲壳动物，给水产养殖业带来了严重的经济损失。已有报道指出野生和养殖的拟穴青蟹均可通过注射、喂养及病蟹（或虾）传染等多种途径感染WSSV。但到目前为止，还没有明确防治WSSV感染的有效办法。

前列腺6跨膜上皮抗原4（six-transmem-brane protein of prostate 4，STEAP4），属于STEAP家族，首先从小鼠的3T3-L1细胞中分离得到，可被肿瘤坏死因子α（Tumor

necrosisfactor α，TNF-α）诱导表达，因此也被称为肿瘤坏死因子α诱导蛋白（TNF-αinduced adipose-related protein，TIARP）。又因其与STAMP1基因的序列有高度相似性而被称为STAMP2[7]。STEAP4由六个跨膜α-螺旋以及细胞内亲水性的N末端和C末端组成。N端包含一个与原核生物F420相似的结构域，即NADP+氧化还原酶结构域；C端的跨膜结构域与酿酒酵母铁还原酶同源。已有研究证明，STEAP4是一种金属还原酶，可以将细胞外Fe³⁺还原为Fe²⁺，Cu²⁺还原为Cu+，将电子从胞内的NADPH转移到细胞外的铁或铜，进而参与调控铁和铜的稳态，在细胞炎症应激的反应中发挥重要作用。STEAP4参与调控代谢过程，并与代谢性疾病相关。STEAP4在前列腺癌中上调表达，具有致癌作用，与结肠癌、肝癌和乳腺癌等癌症的发生相关。除此之外，研究发现STEAP4抗体可抑制人脂肪细胞前体的增殖，促进其凋亡，说明STEAP4可能参与细胞增殖及凋亡途径。

目前关于STEAP4的研究主要集中在哺乳动物，然而无脊椎动物STEAP4的研究极少。本研究克隆了STEAP4 - like基因cDNA序列，对其进行生物信息学分析，利用qRT- PCR技术检测其组织分布情况，及其在WSSV感染后的表达应激情况，构建原核重组表达载体，并诱导表达与纯化重组蛋白GST-STEAP4-like，为解析STEAP4在无脊椎动物中的功能及探究拟穴青蟹抗WSSV免疫反应机制提供参考。

1材料与方法

1.1实验材料

实验动物：健康的拟穴青蟹购买自广东省汕头市牛田洋养殖场，将其暂养于盐度为10‰的海水中，一周后用于后续实验。

主要试剂：Trizol购自Invitrogen公司；DNA Marker、PrimeSTAR2 Max DNA Polymer-ase购自宝日医生物技术（北京）有限公司；琼脂糖凝胶回收试剂盒、质粒小提试剂盒、超薄DNA产物纯化试剂盒、EasyGeno单片段重组克隆试剂盒、FastKing cDNA第一链合成试剂盒（去基因组）、FastKing一步法反转录荧光定量试剂盒（SYBR Green）购自天根生化科技（北京）有限公司；pEASY-Blunt Cloning Kit购自北京全式金生物技术有限公司；ACD抗凝剂：NaCl 450 mM/L，葡萄糖100 mM/L，柠檬酸25 mM/L，柠檬酸钠30 mM／L，加水至1000 mL，调pH值至4.7。

实验引物见表1：

1.2方法

1.2.1RNA的提取与cDNA的合成 首先抽取青蟹血淋巴于含有等体积ACD抗凝剂的RNase-free EP管中，4℃，600×g，离心10 min，收集血细胞。然后用Trizol试剂提取血细胞总RNA，并分别用琼脂糖凝胶电泳与Nanodrop2000检测RNA的完整性及浓度。接着用反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA。

1.2.2 STEAP4基因的克隆与鉴定 根据转录组数据库的已知序列，设计并合成STEAP4 -like基因引物（S-F和S-R），进行PCR反应。PCR反应体系（25μL）：2×PrimeSTAR MaxPremix 12.5μL，ddH20 9.5μL，cDNA模板1μL，上下游引物各1μL。反应程序：98℃10 s，54℃15s，72℃ 1min，35个循环。琼脂糖凝胶电泳方法检测PCR产物，并切下目的条带，然后利用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的片段。将回收的DNA片段与pEASY-Blunt载体25℃条件下，连接30 min后，转化至大肠杆菌DH5a感受态细胞，使用引物M13-F和M13-R进行菌液PCR鉴定，将阳性克隆子并送至广州艾基生物技术有限公司测序。

1.2.3 STEAP4-like基因的生物信息学分析

通过ORF Finder（ http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.Cgi）在线预测分析STEAP4-like基因的开放阅读框及氨基酸序列；利用National Center for Biotechnology Information（http：//www. ncbi. nlm. nih. gov/blast）和SMART software （http：//smart. embl- heidel-berg.de／）预测分析STEAP4或STEAP4-like蛋白的保守结构域；用ExPasy工具（https：//web.expasy.org/protparam／）预测蛋白大小；用Clustal Omega（https：//www. ebi. ac. uk/Tools/msa／clustalo／）对STEAP4-like氨基酸序列进行多序列比对，再用Jalview软件作图；使用MEGA5.2软件构建系统进化树。

1.2.4STEAP4-like基因组织特异性表达分析分别取4只健康青蟹的血淋巴、鳃、肌肉、胃和内皮组织，血淋巴样品利用Trizol法提取血细胞RNA;其余组织于液氮速冻后，用fast 200组织总RNA极速抽提试剂盒提取其总RNA。用Nano-drop 2000紫外分光光度计检测提取的总RNA的质量和浓度后，参照FastKing cDNA第一链合成试剂盒（去基因组）实验操作说明合成cDNA。根据FastKing一步法反转录荧光定量试剂盒（SYBRGreen）说明书，配置反应体系：模板2μL，上游引物和下游引物各0.8μL，ddH20 6.4μL，2×FastRealqPCR PreMix 10μL。qRT-PCR反应条件为：95℃预变性30 s，40个循环的PCR扩增（95℃变性5s，60℃退火30 s）。内参基因为β-actin。每个样品生物学重复3次，根据2-^ΔΔCt算法，计算目的基因的相对表达量。

1.2.5STEAP4-like基因WSSV感染前后表达分析 将健康青蟹在实验室驯养一周后，给每只青蟹注射200μL浓度为1×106 copies／mL的WSSV混悬液。分别在注射0、12、24、48、72 h和96 h后抽取青蟹血淋巴，并离心收集血细胞沉淀用于提取RNA。再用qRT-PCR方法检测STEAP4-like基因在不同时间点的表达量。采用单因素方差分析（ANOVA）和t-test分析显著性差异，P<0.05为显著性差异，P<0.01为极显著性差异。

1.2.6 STEAP4-like原核表达载体构建 用特异性引物r-F和r-R扩增STEAP4-likeORF全长（不含终止密码子），并回收目的片段（具体参照方法1.2.1）；参照TIANGEN的质粒小提试剂盒说明书，提取pGEX-6p-1质粒，并用EcoRＩ和XhoＩ双酶切，37℃，3h。参照TIANGEN超薄DNA产物纯化试剂盒说明书，回收酶切产物，用Nanodrop 2000紫外分光光度计检测浓度后，利用EasyGeno单片段重组克隆试剂盒将其与目的DNA进行连接，50℃，20 min。将连接产物转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中，用引物pGEX5'和pGEX3'进行菌液PCR鉴定，将筛选阳性克隆子并送至广州艾基生物技术有限公司测序。

1.2.7重组蛋白GST-STEAP4-like的诱导表达及纯化将筛选得到的阳性单克隆子过夜活化后，按照1：100的比例分别转接至三瓶含有氨苄青霉素的LB新鲜培养液中，37℃，180 r／min摇培3～4 h，待菌液OD 600 nm值为0.5左右时，取其中一瓶菌液l mL作为未诱导对照组；另外两瓶加入IPTG至其终浓度为0.1 mM，分别置于16℃和37℃，140 rpm诱导培养14 h和3h。分别取5 mL菌液用于检测蛋白表达情况，4℃，6 000 r／min离心5 min收集细菌细胞沉淀。用含0.1% Triton X-100的PBS重悬细菌沉淀，冰上间歇（破碎3s，停5 s）超声破碎至菌液清亮后，4℃，13 000×g离心10 min，收集上清和沉淀。分别加入DTT、5×SDS-PAGE loading buffer（沉淀还需要加PBS）混匀后，95℃加热5 min，10000rpm离心后用于SDS-PAGE电泳。收集16℃，IPTG诱导培养的细菌细胞破碎上清液，参考全式金Proteinlso GST Resin说明书纯化重组蛋白；并SDS - PAGE电泳检测蛋白纯化情况。

2结果与分析

2.1 STEAP4 - like基因的克隆与二级结构预测分析

克隆得到拟穴青蟹STEAP4-like基因cD-NA序列（GenBank号o06s8s07），长1495 bp，开放阅读框（ORF）长1443 bp，编码480个氨基酸（图1）。预测拟穴青蟹STEAP4-like蛋白（Sp-STEAP4-like）大小为52.6 kDa，Sp -STEAP4-like蛋白N端含有烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD）结合位点（图2）。Sp-STEAP4-like和美洲螯龙虾STEAP4-like蛋白（Ha-STEAP4-like）N端都含有一个烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nico-tinamide adenine dinucleotide phosphate，NADP）氧化还原酶辅酶结构域，C端均含有一个铁还原酶跨膜结构域，而Pv -STEAP4-like仅N端有一个NADP氧化还原酶辅酶结构域（图3）。

2.2 STEAP4-like同源性及系统进化树分析

将STEAP4-like蛋白的氨基酸序列与NCBI数据库中其他物种的氨基酸序列进行同源性比对，发现其与三疣梭子蟹（Portunutuss tritu-bercula）相似性最高，为86.46%，其余相似性在40%～60%之间（图4）。系统进化树结果表明，拟穴青蟹STEAP4-like与三疣梭子蟹和突眼蟹（Chionoecetes opilio）聚为一支，亲缘关系最为接近（图5）。具体物种信息见表2。

2.3 STEAP4 -like基因的组织分布

利用qRT-PCR技术检测STEAP4-like基因在拟穴青蟹各组织中的表达情况，并以STEAP4-like基因在血淋巴中的表达量为参照。检测结果表明，STEAP4-like基因在所检测的各组织中均有表达，其中在肌肉中表达量最高，其次在胃、鳃中的表达量较高，在内皮中的表达量最低（图6）。

2.4 WSSV感染拟穴青蟹后STEAP4 - like的表达

本实验通过qRT-PCR技术检测STEAP4-like在注射WSSV后不同时间点的表达情况。结果表明在WSSV刺激后0、12、24、48、72 h和96 h，青蟹血细胞中的STEAP4-Iike基因显著性下调表达（图7）。