凝结芽孢杆菌BC320对南美白对虾生长和血液免疫指标的影响

摘要：为验证一株分离自南美白对虾体内的凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）BC320对南美白对虾（Penaeus vannamei）生长性能和非特异性免疫指标的影响，将1 200尾南美白对虾（平均体重3.24 g±0.2 g）随机分成4组，分别添加0‰、0.5‰、1‰、1.5‰的BC320，每组300尾，3个重复，每个重复100尾。经40 d养殖后，检测平均增重率（AWG）、特定生长率（SGR）、饲料系数（FC）和成活率（SR）等生长指标和超氧化物歧化酶（SOD）、酸性磷酸酶（ACP）、碱性磷酸酶（ALP）、溶菌酶（LSM）、过氧化物酶（POD）等免疫指标。结果显示，终末体重、增重率和特定生长率指标，各处理组与对照组相比均有显著增加，但在添加1‰和1.5‰之间没有显著性差异；当添加量为1‰时，试验组的SOD、ACP、ALP和POD与对照组均有显著差异，LSM与对照组之间没有显著差异。本试验结果表明，凝结芽孢杆菌BC320可促进南美白对虾生长，提高其非特异性免疫水平。

关键词：凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）; 南美白对虾（Penaeus vannamei）; 生长; 血液免疫指标

2021年我国南美白对虾（Penaeus vannamei）产量占全部虾产量的35.12%[1]，南美白对虾已经成为我国虾类养殖中的主要品种。然而，近些年由于环境压力和病害引起的养殖风险明显增加，在一些地区造成了较大的经济损失[2]。同时，抗生素和微生态制剂的使用已成为养殖生产必须关注的问题之一。抗生素与生俱来的耐药菌株传播和抗生素残留等问题，以及大量使用抗生素对环境的危害问题[3-4]，使微生态制剂、植物提取物、中药制剂等成为替代抗生素的热门种类。水产养殖动物颗粒饲料的特殊制作工艺，造成不耐高温的乳酸菌和酵母菌损失率过高，而能耐高温的常用芽孢菌（主要是枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌）不能产生乳酸，在肠道微生态平衡调节方面有所欠缺。

凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）最早于1915年发现于腐败的炼乳中[5]，属厚壁菌门（Firmicutes），杆菌纲（Bacilli），芽孢杆菌目（Bacillales），芽孢杆菌科（Bacillaceae），芽孢杆菌属（Bacillus），为兼性厌氧菌，在肠道可抑制有害菌，并能促进双歧杆菌等有益菌的生长和繁殖。本实验室于养殖南美白对虾肠道中分离到一株凝结芽孢杆菌BC320，经验证具有较强的产酸能力和形成芽孢的能力。为验证凝结芽孢杆菌BC320对南美白对虾生长和血液免疫指标的影响，开展了本研究，以期为凝结芽孢杆菌BC320在养殖生产上的应用提供数据支持。

1材料与方法

1.1菌株来源及菌剂制备

菌株BC320株为河北农业大学海洋学院病害与微生物实验室从曹妃甸南美白对虾养殖现场中采集分离后保藏，从冰箱取出后迅速解冻，以无菌操作涂布于YPD平板培养基。取单菌落接入液体培养基，发酵30 h，添加0.5%牛血清白蛋白第五组份（BSA V）作为保护剂冻干。冻干的菌剂以膨润土调整活菌数为1×1010 CFU/g后添加至饲料中。

1.2试验动物及试验设计

1.2.1饲料配制本试验中使用自制饲料，基础配方为：进口鱼粉57%、酵母粉2.5%、大豆磷脂8%、豆粕18%、杂鱼粉8%、次粉5.5%、氯化钠0.5%，另加预混料0.5%。预混料为市售2‰预混料并分别添加0‰、0.5‰、1‰、1.5‰的凝结芽孢杆菌（活菌数1×10¹⁰ CFU/g），用膨润土补足到5%，编号分别为C0、T1、T2、T3。原料混合后压制成破碎料和粒径1.0 mm的颗粒料，于4 ℃冰箱保存备用。

1.2.2饲养管理南美白对虾（平均体重3.24 g±0.2 g）购自山东滨州某育苗场，运回后先在2 m×2 m×1 m的暂养池中暂养1周，期间投喂破碎料。暂养结束后，挑选规格一致、外观健康的虾，随机分成4组（对应C0、T1、T2、T3四组饲料），每组300尾，3个重复，每个重复100尾，使用1.2 m×0.45 m×0.45 m水族箱进行养殖试验。

试验期间水温控制在（28±2）℃，每天投料4次，每隔6 h投1次。试验期间，定期排出水底部沉淀的粪便和杂质，每天换水大约30%。开始试验时投饲量按虾体重的约20%计算，随摄食和生长情况逐步做调整，至试验结束时约按虾体重的6%计算。

1.2.3生长性能指标测定

试验周期40 d。试验开始前测定对虾体重记录为初始体重，试验结束后停止投料后24 h称重记录，为终末体重。试验结束后计算以下指标：

AWG=（W₁-W₀）/W₀×100%；

SGR=[ln（W₀）-ln（W₁）] /T×100% ；

FC=F_t/W_t；

SR=（N₁/N₀）×100%；

式中：AWG为平均增重率，%；W₁为终末体重，g；W₀为初始体重，g；SGR为特定生长率，%/d；T为试验天数，d；FC为饲料系数；F_t为试验期间摄入的饲料总量，g；W_t：为试验期间总增重，g；SR为成活率，%；N₁为试验结束时尾数，尾；N₀为试验开始时尾数， 尾。

1.2.4血清的生化分析及血清抗氧化分析

试验结束后，停食24 h，每组选择10尾虾从腹部血窦抽取血淋巴，置于2.5 mL的一次性离心管中，4 ℃静置过夜，第二天3 000 rpm离心10 min，取上清液保存于-80 ℃备用。

超氧化物歧化酶（SOD）、酸性磷酸酶（ACP）、碱性磷酸酶（ALP）、溶菌酶（LSM）和过氧化物酶（POD）均使用试剂盒（南京建成生物工程研究所有限公司）并参考生产商的使用说明进行检测。

1.2.5数据整理与统计分析数据在EXCEL中进行汇总并进行分析，试验结果以平均值±标准误差表示，组间差异采用单因素方差分析（One-way ANOVA），如组间存在显著差异，则继续进行最小显著差异方法（LSD）做多重比较。以P＜0.05表示具有显著差异。

2结果

2.1BC320对南美白对虾生长的影响

添加不同比例的凝结芽孢杆菌BC320对南美白对虾生长指标的影响见表1。结果显示，添加凝结芽孢杆菌后，各处理组与对照组相比终末体重、增重率和特定生长率均有显著增加，但T2和T3组之间没有显著差异。1‰添加组饲料系数为118，在所有试验组中最低；成活率在1‰添加组最高，但不同添加组之间没有显著差异（P＞0.05）。

2.2BC320对南美白对虾血液生化指标的影响

图1（封三）显示，SOD在C0组和T2、T3组之间差异显著，而C0组和T1组之间差异不显著；T1和T2之间差异显著而和T3之间差异不显著。

从图2（封三）可以看出，添加凝结芽孢杆菌后，南美白对虾血清中的ACP指标随BC320添加量的增加而升高，但在添加量更高的T3组和次高添加量的T2组之间没有显著增加。C0和T1组之间没有显著差异，T2和T3组之间也没有显著差异。

从图3（封三）可以看出，随着添加浓度（05‰、10‰和1.5‰）的升高，血清中ALP的浓度也随着升高。3个添加浓度对ALP的升高效果与对照组C0相比较均为差异极显著（P＜001）。

从图4（封三）可以看出，仅在T1组（添加量0.5‰）和对照组之间的LSM有显著差异，T2和T3组（添加量分别为1‰和1.5‰）与对照组之间没有显著差异。各处理组之间也没有显著差异。只有T1组与对照组相比有显著差异。

从图5（封三）可以看出，对照组C0与各处理组之间的POD均有显著差异（P＜0.05），而不同添加量的处理组之间不存在显著差异。

3讨论

益生菌在生长过程中可产生淀粉酶[6]、脂肪酶[7]、蛋白酶[8]等多种酶和有机酸、多肽[9]等物质，在动物肠道内可以帮助宿主消化食糜和吸收营养成分，提高宿主对营养成分的更高效利用。一般认为，乳酸菌可以在肠道分泌有机酸，造成较低的pH环境，抑制病原菌的生长，并能分泌促生长因子，从而促进对食物的消化吸收。凝结芽孢杆菌可以起到类似乳酸菌的作用，表现出促生长的作用，本试验的结果和部分其他研究人员的结果相似[10-11]。

益生菌促进养殖动物成活率的提高，一般认为是由于益生菌能促进宿主肠道微生态平衡，提高宿主对不良环境的抵抗力。本研究中，添加凝结芽孢杆菌组的成活率在各处理组之间没有显著差异，而和对照组之间均有显著差异。

益生菌可以刺激宿主的体液免疫和细胞免疫水平的提高，包括促进一些非特异性免疫因子分泌的增强等[12]。超氧化物歧化酶SOD在动物的抗氧化应激反应体系中占有重要地位[13-15]。当对虾受到环境胁迫如低氧、高温等恶劣条件时，体内SOD基因会应激而增强表达。所以血清中SOD水平的高低可反映机体的免疫状态。本研究中，SOD在添加0.5‰的处理组和对照组之间没有显著差异，表明低剂量的凝结芽孢杆菌不能刺激南美白对虾血清中SOD的显著升高。在袁丰华等[16]的研究中，使用10×10⁹ CFU/g的菌剂以0.1%、0.5%和1.0%的比例分别添加进尖吻鲈饲料中，饲养50 d后检测，发现尖吻鲈血清中SOD水平在试验组比对照组高，但是与对照组之间没有显著差异，可反映出益生菌对动物的影响除了受益生菌种类影响之外，也受动物种类、进行试验时的生理状态等的影响。本研究中，使用的凝结芽孢杆菌添加活菌数为1×10¹⁰ CFU/g，试验动物为南美白对虾，在低添加量组（T1组，05‰添加）和对照组之间SOD没有显著差异。在高添加量组（T2组，1.0‰添加；T3组，1.5‰添加）和对照组之间均有极显著差异（P＜0.01）。表明，使用益生菌（例如凝结芽孢杆菌）要达到益生效果，添加量有一个阈值，超过这个阈值的添加量效果才能体现出来。在王明阳等[10]的研究中，添加凝结芽孢杆菌的量为1×10¹¹ CFU/kg，试验动物同样为南美白对虾，试验结果发现对血清SOD没有显著影响。推测结果差异可能的原因是：菌株不同对宿主的刺激程度有差异；试验动物不是同一个批次，健康状态有差异；环境条件的差异等。

已有多个研究发现碱性磷酸酶ACP与动物的免疫水平相关，在甲壳动物等低等生物的非特异性免疫中发挥重要作用[17-20]。有研究表明ACP的水平与刺激物的剂量有关，存在剂量依存性[21]。本试验中同样发现ACP的水平随凝结芽孢杆菌添加量的增加而增加，即存在剂量依存现象，表明ACP水平可能是机体免疫监测的一个常规指标。

碱性磷酸酶ALP可能在机体受到外源物质刺激时被动地升高浓度，以应对可能的危害[22]。本研究中，各处理与对照组相比ALP均为显著差异，但T2组的平均值要略低于T1组，可能ALP同样有添加量范围的问题。

溶菌酶LSM是机体非特异性免疫的重要组成部分，可以裂解革兰氏阳性菌细胞壁中的乙酰氨基多糖，破坏和消除侵入体内的异物[17，23]。本试验中，T1组（0.5‰添加量）和对照组之间在血清LSM水平有显著差异，而高添加量组（T1、T2组）和对照组之间在血清SOD水平没有显著差异，表明LSM水平的升高有一个最高点。

过氧化物酶POD是广泛存在于生物体内的一种氧化酶，主要作用是氧化有害底物防止形成羟基自由基[24]。王俊等[25]研究发现，在脊尾白虾饲料中添加凝结芽孢杆菌可以提高其血清中POD水平，并且随着添加量的增加，POD水平也增高。本研究中，南美白对虾血清中POD水平也随添加量增加而升高，并且各处理组（T1、T2、T3）与对照组相比均为显著增加。