刺参体腔细胞免疫相关基因对溶藻弧菌感染的响应

摘要：为探讨分离自患病刺参（Apostichopus japonicus）的一株溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）感染刺参后，刺参体腔细胞免疫相关基因的响应变化，分别给刺参注射100 μL生理盐水（对照组）和1×109 CFU/mL溶藻弧菌菌液（实验组），用荧光定量PCR技术，检测24 h内刺参体腔细胞Lys、Rel和p105基因表达的变化。结果表明，注射生理盐水对刺参体腔细胞Lys、Rel和p105基因表达量无显著影响。感染溶藻弧菌后，实验组刺参体腔细胞中溶菌酶基因的表达量在24 h显著升高，且1 h和24 h时的表达量显著高于对照组（P<0.05）;刺参体腔细胞中p105基因在感染后表达量呈上升趋势，3 h达到峰值，在3 h和6 h，p105基因的表达量显著高于对照组（P<0.05）;刺参体腔细胞Rel基因表达量在感染后无显著变化。可见刺参感染溶藻弧菌后其体腔细胞Lys和p105基因的表达在短时间内迅速响应。

关键词：刺参（Apostichopus japonicus）;溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）;体腔细胞;基因表达

溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）属于弧菌科，弧菌属，革兰氏阴性菌，是一种常见的海洋致病菌，对鱼、虾、贝等海水养殖动物都有较强的致病性[1-4]。溶藻弧菌会在侵袭和增殖过程中对机体造成细胞和组织损伤以及其代谢产物干扰和破坏机体的局部或全身的正常新陈代谢或机能[3-5]。卢芷程等[5]的研究结果表明溶藻弧菌感染凡纳滨对虾后会启动其免疫机制并产生活性氧（ROS）和一氧化氮（NO）以对抗病原菌入侵，随感染时间的延长抗氧化系统会被激活。李晶晶等[6]在研究中也表明凡纳滨对虾感染溶藻弧菌后，需要不断保持较高的免疫水平，其体内的3种Toll样受体（Toll-like receptors）基因在血淋巴与鳃中的表达量均显著升高。溶藻弧菌也是刺参病害的主要致病菌之一[7]，但关于其对刺参免疫的研究较少。刺参体腔细胞在刺参非特异性免疫中起着非常重要的作用，是其最基本的防御武器[8]。溶菌酶是刺参体腔细胞重要的免疫抗菌蛋白，其活性是表征机体对细菌性病原抵抗能力的重要指标[9]。核因子κB（NF-κB）信号通路是先天性免疫中最为重要的途径，Rel、p105是该信号通路上重要的转录因子，同时Rel、p105基因已在刺参上被成功克隆到序列[10]。因此本研究聚焦刺参体腔细胞的非特异性免疫，选取刺参体腔细胞溶菌酶（Lys）、Rel、p105基因为目标基因，探讨刺参体腔细胞对溶藻弧菌（从患病刺参体壁分离）刺激后24 h内Lys、Rel、p105免疫基因的响应，为进一步探究刺参抵抗溶藻弧菌感染的免疫机理提供基础参考。

1材料与方法

1.1实验动物

实验所用刺参购买于东方海洋生物科技有限公司。选取平均体重为3 g的健康刺参200头，暂养于连续充气的水箱中，常规养殖管理，暂养1周。实验开始前将刺参分为实验组与对照组。

1.2实验菌株

实验菌株分离自患病刺参，经16S rDNA鉴定为溶藻弧菌。使用2216E培养基，28 ℃对其进行液体培养，培养过夜后，离心（6 000 r/min，10 min，4 ℃）收集菌体，菌体用0.85%的生理盐水重悬，将细菌浓度调节至1×109 CFU/mL备用。

1.3溶藻弧菌的急性感染与样品采集

注射实验开始前，取18头刺参，每6头刺参的体腔细胞混在一起，作为一个重复，即为0时刻的样本。对照组每头刺参体壁注射0.1 mL生理盐水，多点注射。实验组每头刺参体壁注射0.1 mL浓度为1×109 CFU/mL的溶藻弧菌菌液，多点注射。注射后分别在1、3、6、12、24 h取样，每个时刻随机取18头刺参，解剖刺参获取刺参的体腔液，每6头刺参的体腔液混合在一起作为一个重复样本，每一时刻三个重复。体腔液转入离心管中，4 000 r/min，4 ℃离心，去上清，每管体腔细胞加入1 mL TransZolTM Up（北京全式金），并用枪反复吹吸，使体腔细胞裂解，液氮速冻，转入-80 ℃冰箱保存，用于体腔细胞RNA的提取。

1.4免疫相关基因表达量的测定

1.4.1刺参体腔细胞RNA的提取取-80 ℃保存的刺参体腔细胞，按照TransZolTM Up Plus RNA Kit （北京全式金）试剂盒说明提取RNA。用1.5% 琼脂糖凝胶电泳检测RNA是否被降解;用微量紫外分光光度计检测RNA的浓度。RNA-80 ℃保存备用。

1.4.2cDNA的合成和荧光定量PCR使用TransScript Green Two-Step qRT-PCR SuperMix （北京全式金）试剂盒对刺参体腔细胞RNA进行反转录。向无RNAase的PCR管中依次加入500 ng模板RNA、4 μL 5×TransScript All-in-One SuperMix for qPCR、1 μL gDNA Remover，补足RNase-free Water 至20 μL。轻轻混匀，42 ℃孵育15 min。85 ℃加热5 s。得到的cDNA -20 ℃ 保存备用。

引物设计参考Wang等[10]、Yang 等[11]，由上海生物工程有限公司合成，引物序列见表1。按照TransScript Green Two-Step qRT-PCR SuperMix （北京全式金）试剂盒操作说明，进行荧光定量PCR。扩增反应体系如下：Template 1 μL、Forward Primer 0.4 μL、Reverse Primer 04 μL、2×TransStart Top Green qPCR SuperMix 10 μL、dd H2O 8.2 μL。PCR 程序为： 95 ℃ 30 s;  95 ℃ 10 s;56 ℃ 25 s;72 ℃ 25 s，共40个循环。以Cytb为内参基因，基因的相对表达量以 2-ΔΔ CT法进行计算[12]。

1.5数据处理和统计分析

使用SPSS 17.0对不同时刻下的数据进行单因素方差分析，Tukey′s法进行多重比较;同一时刻下的数据进行t检验;处理间P<0.05则认为差异显著。

2结果

2.1溶藻弧菌感染后刺参体腔细胞中Lys mRNA的表达

溶藻弧菌感染下刺参体腔细胞Lys表达量变化如图 1所示。注射生理盐水的对照组在0～24 h内Lys表达量并无显著变化（P>0.05）。注射1×109 CFU/mL溶藻弧菌的实验组Lys表达量在1 h、24 h显著高于对照组（P<0.05）;且24 h的表达量显著高于0 h时的表达量（P<0.05）。

2.2溶藻弧菌感染后刺参体腔细胞中Rel mRNA的表达

溶藻弧菌感染下刺参体腔细胞Rel表达量变化如图 2所示。注射生理盐水的对照组在0～24 h内刺参体腔细胞中Rel基因的相对表达量并无显著变化。注射1×109 CFU/mL溶藻弧菌的实验组Rel表达量在不同时刻没有显著变化，同一时刻与对照组也没有显著差异（P>0.05）。

2.3溶藻弧菌感染后刺参体腔细胞中p105 mRNA的表达

溶藻弧菌感染下刺参体腔细胞p105表达量变化如图 3所示。注射生理盐水的对照组在0～24 h内p105表达量并无显著变化（P>0.05）。注射1×109 CFU/mL溶藻弧菌的实验组p105表达量随着时间的增加呈现先上升后下降的趋势，在3 h和6 h显著高于对照组（P<0.05），与0 h相比3 h和6 h的实验组p105表达量显著上调（P<0.05）。

3讨论

溶菌酶作为机体天然免疫系统中一种古老的抗菌酶之一，其杀菌特性十分强大，可催化细菌细胞壁肽聚糖与N-乙酰氨基葡萄糖和N-乙酰胞壁酸之间的 β-（1，4）-糖苷键的水解以达到消亡细菌的目的[13]。本实验结果表明溶藻弧菌（V.alginolyticus）侵染刺参，能显著上调溶菌酶基因的表达，在溶藻弧菌急性感染后的1 h和24 h的对照组与实验组之间存在显著的差异。这与Li 等[14]用1×107 CFU/mL 灿烂弧菌（Vibrio splendidus）浸泡刺参的研究结果一致，其结果显示V.splendidus刺激能显著上调刺参溶菌酶基因的表达。Wang等[15]在刺参的免疫因子的表达研究中显示感染1×109 CFU/mL（V.splendidus）后溶菌酶mRNA的表达水平呈现先上升后下降继而再上调的趋势，分别在10 min和240 min时达到峰值，而本实验中也显示出在感染溶藻弧菌（V.alginolyticus）后24 h刺参体腔细胞中溶菌酶基因的表达呈现先上升后下降的趋势，并在24 h达到峰值。这说明弧菌感染后刺参体腔细胞的溶菌酶基因对病原菌的感染在短时间做出了积极的免疫反应，但其对溶藻弧菌刺激存在阶段性的响应。

NF-κB转录因子是一类普遍存在于生物体内十分重要的调节因子，它可控制各种基因的转录过程。NF-κB因子的表达和激活与机体免疫存在着密切的联系，Rel、p105又称为NF-κB1都是NF-κB转录因子蛋白家族的成员之一，并在海参的免疫中起着重要作用[10，16]。本实验发现感染溶藻弧菌（107CFU）后刺参体腔细胞p105 mRNA在1～24 h内呈现出先上升后下降的趋势，在3、6 h显著高于对照组及0 h的表达量。Wang等[15]用109 CFU灿烂弧菌（V.splendidus）侵染刺参发现刺参体腔细胞中p105基因的表达水平在1、2、4 h连续显著升高，在4 h达到峰值，是对照组的6.12倍。这表明刺参体腔细胞p105基因在刺参体腔细胞的免疫防御机制中起着重要的作用，但对109 CFU灿烂弧菌反应更为强烈而对107 CFU溶藻弧菌刺激更为温和，这有可能与菌液的作用浓度有关。同时研究发现109 CFU灿烂弧菌刺激后，刺参体腔细胞中Rel基因的表达量显著增加[15]，10 min时达峰值，30 min后，表达量呈下行但在1、2、4 h仍显著高于初始水平。在本实验中，溶藻弧菌（V.alginolyticus）（107 CFU）感染后的刺参Rel基因的表达在1～24 h内没有显著变化。由此可见刺参体腔细胞Rel基因对灿烂弧菌和溶藻弧菌的响应完全不同。阎慧等[17]用0.2×105 CFU/mL 鳗弧菌（Vibrio anguillarum）侵染中国对虾，在45 min、70 min、2、3、5、8、14、23 h对Rel基因的表达进行分析，结果表明在3 h和5 h，血细胞中Rel基因被显著下调，而淋巴器官中的Rel 基因被显著上调。由此可见同一病原对中国对虾不同组织中Rel基因的表达影响也显著不同，这提示我们关于溶藻弧菌对刺参体腔细胞Rel基因的影响，应该更加密集地设计取样时间，并且延长观测时间，以更加全面地揭示Rel基因对溶藻弧菌刺激的响应。

参考文献：

[1] WANG Y D，HUANG S J，CHOU H N，et al.Transcriptome analysis of the effect of Vibrio alginolyticus infection on the innate immunity-related complement pathway in Epinephelus coioides[J].BMC Genomics，2014，15（1）：1102.

[2] 苑淑宾，朱爱意.溶藻弧菌对水产动物致病性及其防治的研究进展[J].浙江海洋学院学报（自然科学版），2012，31（3）：256-264.

[3] 苗鹏飞，杨映，谭淑雯，等.罗氏沼虾致病性溶藻弧菌的鉴定及药敏分析[J].水产科学，2018，37（3）：384-388.

[4] YANG M J，CHENG Z X，JIANG M，et al.Boosted TCA cycle enhances survival of zebrafish to Vibrio alginolyticus infection[J].Virulence，2018，9（1）：634-644.