基于重组酶聚合酶扩增结合侧流层析试纸条 快速检测鲤疱疹病毒2型的方法研究

摘要：为建立CyHV-2的重组酶聚合酶扩增结合侧流层析（RPA-LFD）快速检测鲤疱疹病毒2型（Cyprinid herpesvirus 2，CyHV-2）的方法，针对鲤疱疹病毒2型的DNA聚合酶基因设计引物和探针，优化反应温度和时间条件，建立了鲤疱疹病毒2型的RPA-LFD检测方法，并将样品简易处理方法运用于该方法对实验室保存的鲫组织样品进行检测。结果显示，该RPA-LFD检测方法最佳反应条件为40 ℃ 20 min，最低检出限为6×100 copies/μL，与荧光PCR的灵敏度相当，与其他鲤疱疹病毒等无交叉反应;运用该方法并结合待检样品简易处理方法（直接RPA法）对50份鲫组织样品进行处理和检测，其结果与运用国家标准（GB/T 36194-2018）中荧光 PCR方法检测结果一致。本文建立的RPA-LFD检测方法具有操作简单、反应迅速、灵敏度高、特异性强的优点，适于在水产养殖场和基层部门用于鲤疱疹病毒病的辅助诊断和监测。

关键词：鲤疱疹病毒2型（CyHV-2）;重组酶聚合酶扩增（RPA）;侧流层析试剂条（LFD）;直接RPA法

鲤疱疹病毒2型（Cyprinid herpesvirus 2，CyHV-2），也称为金鱼造血器官坏死病毒，是一种感染异育银鲫、金鱼、鲫及其变种的高致病性鱼类病毒。由于该病毒是第二个分离自鲤科鱼类的疱疹病毒，国际病毒系统分类与命名委员会将其命名为鲤疱疹病毒2型。CyHV-2病毒对鱼卵、鱼苗、鱼种和亲鱼均可感染，危害严重。近年来，由CyHV-2引起的鲫造血器官坏死病是国内异育银鲫养殖出现“鳃出血”引发暴发死亡的一种高度传染性疾病，死亡率可达90%[1]。通常病毒检测的首选方法是细胞培养分离技术，由于目前分离CyHV-2病毒的敏感细胞系培养操作等需要条件较高，分子生物学诊断方法仍是该病毒最常用的检测方法。我国国家标准（GB/T 36194-2018）金鱼造血器官坏死病毒检测方法中采用了PCR和荧光PCR法，其也需要较昂贵的仪器、实验环境及专业培训的实验室人员，较难在基层单位尤其是乡镇以及普通养殖户推广应用。

重组酶聚合酶扩增技术（Recombinase polymerase amplification，RPA）是Piepenburg等2006年提出的一种新型恒温核酸扩增技术，它的优势在于可在常温下十几分钟内将痕量核酸模板扩增到可检测水平[2]。目前RPA方法已经应用于鲤春病毒血症病毒[3-4]、白斑综合征病毒[5]、传染性造血器官坏死病毒[6]、Ⅱ型鲤疱疹病毒[7-8]、鲤浮肿病毒[9]、锦鲤疱疹病毒[9]、传染性脾肾坏死病毒和鲶爱德华氏菌[10]等水生动物病原检测中。RPA扩增结合侧流层析试纸条（lateral flow dipstick，LFD）检测技术的应用，可以实现病毒核酸检测结果的肉眼直接观察。本文通过鲤疱疹病毒2型的RPA-LFD检测方法的建立以及样品简易处理方法的应用，为基层单位和养殖场中鲫造血器官坏死病的辅助诊断监测提供一种操作简单、反应迅速、灵敏度高、特异性强的检测方法。

1材料与方法

1.1实验毒株及主要试剂

鲤疱疹病毒（Cyprinid herpesvirus 2，CyHV-2）、鲤痘疮病毒（Cyprinid herpesvirus 1，CyHV-1）、锦鲤疱疹病毒（Cyprinid herpeavirus 3，CyHV-3）、鲤春病毒血症病毒（Spring viraemia of carp virus，SVCV）、草鱼呼肠孤病毒（Grass carp reovirus，GCRV）、鲤浮肿病毒（Carp edema virus，CEV）等水生动物病毒病料及检测用鲫样品均由本中心实验鉴定并保存。CyHV-2的鉴定方法参照国家标准（GB/T 36194-2018）金鱼造血器官坏死病毒检测方法。ELISA包被缓冲液、PBST缓冲液购自北京索莱宝公司;DNA提取试剂盒、病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒购自天根生化科技（北京）公司;TwistAmp nfo Kit试剂盒，Milenia HybriDetect1试纸条;PCR相关试剂为Takara产品。

1.2所用主要仪器设备

台式高速冷冻离心机：Eppendorf 5430R;PCR仪：Life ProFlex、Biometra;凝胶成像分析仪：BIO-RAD Gel Dox R+、电泳仪BIO-RAD powerPac basic、荧光定量PCR仪AB QuantStudio5;超微量核酸蛋白分析仪：IMPLEN P330;干式恒温器：MK-20等。

1.3RPA引物和探针的设计

选取鲤疱疹病毒2型的DNA聚合酶基因作为目标序列，在NCBI基因库中检索（序列号：AY939863.1），使用Primer Premier5.0软件结合TwistDx公司的设计手册（https：//www.twistdx.co.uk/en/rpa）设计PRA引物和探针，本实验设计引物和探针为：上游引物C2F：ACTGCGTGCTGCTCGATTGGAAAAAGATACC

GGC，下游引物C2R：Biotin -TCTTTCTCGGTCTTGATGCGTTTCTTGTACTG，探针C2P：FAM-AGAGATCAAGGAATACCCGCACAGCGAAGACC/THF/GTACACGATCCTGTGC-（C3spacer），委托上海生工生物工程有限公司合成。

1.4配制反应预混液与扩增

参照TwistAMP nfo kit试剂盒推荐反应体系，在1.5 mL离心管按照以下比例配制反应预混液，充分混匀并短暂离心。引物C2F（10 μM）2.1 μL、引物C2R（10 μM）2.1 μL、nfo探针C2P（10 μM）0.6 μL、Rehydration buffer缓冲液29.5 μL、模板DNA 2.0 μL、ddH2O 11.2 μL，总体积47.5 μL。将47.5 μL反应预混液加入盛有冻干酶制剂的反应管中，手指轻弹使冻干粒充分溶解并短暂离心。吸2.5 μL醋酸镁（MgOAc，280 mM）到管盖内壁，通过简短离心使醋酸镁进入预混液而启动反应（加入MgOAc反应即刻进行）。反应结束后用侧流层析试纸条分析。对于低浓度模板（小于103拷贝/反应），反应4 min后取出反应管，手轻弹混匀并短暂离心，放回金属浴中继续反应可提高反应效率。

1.5试纸条检测

每样品吸取100 μL试纸条配套HybriDetect Assay Buffer缓冲液或者自备PBS缓冲液到一洁净PCR管中。吸取10 μL反应产物加到上述缓冲液或者加到试纸条样品区。然后将试纸条样品区不超上限位直立放入缓冲液，数分钟后观察试纸条层析结果。

1.6反应条件优化

优化实验以重组质粒（6×105拷贝/μL）为模板。采用方阵法对反应温度（20、25、30、35、40、45 ℃）和反应时间（5、10、15、20、25、30 min）进行试验优化，反应体系按照步骤1.4中TwistAMP nfo kit试剂盒推荐。优化试验的反应产物通过LFD试纸条检测。选择阳性样品出现最强检测线和质控线，阴性样品不出现检测线仅出现质控线时的条件作为RPA-LFD的优化条件。

1.7灵敏度试验

1.7.1重组质粒的构建与定量采用GB/T 36194-2018标准中CyHVpol引物扩增CyHV-2病毒DNA聚合酶基因362 bp特异性序列。测序确认后将其克隆至pMD18T载体上，构建重组质粒pMD-18T-CyHV-2。该重组质粒经测序鉴定正确后，采用超微量核酸蛋白分析仪测定其浓度，根据公式：{质粒浓度（ng/μL）×10-9/[660×（基因片段长度+载体长度）]}×6023×1023=质粒拷贝数（拷贝/μL），换算为其拷贝数。

1.7.2比较建立的RPA-LFD检测方法与国家标准GB/T36194-2018中CyHV2荧光PCR检测方法的灵敏度。将阳性重组质粒作为标准品进行10倍系列稀释，浓度从6×107～6×100拷贝/μL梯度稀释，分别以其为模板进行RPA-LFD检测和荧光PCR检测。

1.8特异性试验

用病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒抽提本实验室保藏SVCV、GCRV核酸，并将其逆转录为相应的cDNA，用DNA提取试剂盒分别提取本实验室保藏的CyHV-1、CyHV-2、CyHV-3、CEV基因组DNA。利用已建立的RPA-LFD检测方法检测上述cDNA和DNA。

1.9临床样品检测应用

将待检样品简易处理方法应用于建立的RPA-LFD法检测鲫样品，并与国家标准方法检测结果比较，评估该方法的稳定性和可靠性。

1.9.1待检样品简易处理方法（直接RPA法）将待检测样品约100 mg的组织匀浆液与碳酸氢盐缓冲液（ELISA包被液）混合，吸取50 μL移入PCR管中，放入金属浴中50 ℃孵育15 min。用200 μL PBS-T（含0.05% Tween20）洗3次。加入47.5 μL RPA反应预混液（含缓冲液、引物、探针和水），95 ℃ 10 min，迅速放置冰上2～3 min，稍离心。以上处理的反应液移入含RPA酶的反应管中，再加入2.5 μL醋酸镁启动剂放入金属浴中进行反应，反应完成后用试纸条检测。

1.9.2荧光PCR法检测按照DNA提取试剂盒说明书提供的方法进行DNA抽提，采用国家标准（GB/T 36194-2018）中荧光PCR法对待检样品进行检测。

2结果

2.1最佳反应条件选择

本试验在25～45 ℃温度反应20 min均可出现肉眼可分辨较清晰检测带。综合比较不同反应温度和反应时间检测结果，本实验选择40 ℃反应20 min作为CyHV-2检测的最佳反应条件。

2.2灵敏度试验

采用10倍倍比稀释的阳性重组质粒作为模板，比较RPA-LFD方法与荧光PCR的敏感性。结果显示，本文建立的RPA-LFD方法最低检出限为6×100拷贝/μL（图2），荧光PCR检出限也为6×100拷贝/μL（图3），表明本文建立的RPA-LFD方法敏感性与荧光PCR相当。

1～6为温度20、25、30、35、40、45 ℃反应20 min时试纸条检测结果;7～12为40 ℃反应5、10、15、20、25、30 min时试纸条检测结果。

1～8为10倍系列稀释质粒模板浓度：6×107拷贝/μL～6×100拷贝/ μL;9为阴性对照

2.3特异性试验

分别以SVCV、GCRV的cDNA和CyHV-1、CyHV-2、CyHV-3、CEV的DNA为模板，验证建立的检测CyHV-2的RPA-LFD方法的特异性。结果显示，仅CyHV-2的DNA模板的反应产物在试纸条上同时出现检测线和质控线。阴性对照（RNase-free水）及SVCV、GCRV、CEV、CyHV-1、CyHV-3均未出现扩增，仅在试纸条上显示质控线（图4）。由此可知，该方法能特异性扩增出CyHV-2中的靶序列，而不与其它病毒核酸发生交叉反应。

1～7依次为为：CyHV-2，阴性对照，SVCV，GCRV，CyHV-1，CyHV-3，CEV。

2.4临床样品检测

利用所建立的RPA-LFD方法与国家标准（GB/T 36194-2018）中荧光 PCR 方法分别检测2018—2021年收集保存于本实验室鲫样品50份。结果显示RPA-LFD检测出阳性34份、阴性16份;荧光PCR检测出阳性34份、阴性16份，两种方法检测结果一致，符合率100%。表明本文建立的RPA-LFD方法可用于CyHV-2待检样品的现场检测。

3讨论

在病毒性疾病的潜伏感染期，机体患病症状大多表现不明显，常给疾病的早期诊断带来困难。CyHV-2作为鲫疱疹病毒病的病原，早期检测发现该病毒感染，尽早采取积极有效的防控措施是阻断该病毒感染传播，降低鱼类发病死亡的关键环节。重组酶聚合酶扩增技术作为一种新型恒温核酸扩增技术，具有特异性好、灵敏度高（1～10拷贝）的优点，可以与实时荧光定量PCR相媲美[11]。RPA技术与PCR比较有一些基本的优势，如待检样品在RPA扩增前只需要简单处理，甚至可以在未经处理的尿液样品中可以直接检测某类衣原体[12];另外，RPA还具有耐PCR抑制因子的能力，已有研究显示RPA在某些已知的PCR抑制因子如未稀释血清、肝素（0.5 U）、血红蛋白（50 g/L）、乙醇（4% V/V）等存在时仍然可以有效进行[13-14]。RPA被认为是可能替代PCR的一种核酸扩增技术，结合侧流流层析试纸条检测其扩增产物，可以提高RPA方法的特异性和检测速度[15]。