基于固氮鱼腥藻和蛋白小球藻藻类生物技术在富藻山楂绿色生产中的应用研究

0引言

果树产业作为世界农产品生产三大项之一[1]，其发展质量、发展水平对乡村振兴的意义极为重大。据不完全统计，我国山楂栽培面积已达700万亩，约占我国果树总面积的10%，2020年产业规模在200亿元左右。山楂是一种药食同源植物，广泛应用于医药、食品及轻工业等领域。但随着种植规模不断扩大，出现了种质资源退化、群体病害增加等生产问题，特别是投入品中化肥使用量不断增加，致使山楂品质受到极大影响，因此迫切需要研究一种生态、绿色、高效、安全的新型山楂栽培技术，其中利用新型环境友好型生物技术是极为重要的一环。

山西闻喜七里坡和绛县同处我国山楂优势生产区，分别有“三晋山楂第一村”和“中国山楂第一县”的美誉[2]，山楂种植总面积达15万亩左右。山楂不仅是当地特色名产，而且还是国家农产品地理标志保护产品和新时代实现乡村产业振兴的中坚力量。为进一步提升品质，减少化肥农药投入，当地依托中央地理标志保护工程，以特色产业高质量发展的“五品模式”[3]为路径，围绕品质提升开展了基于固氮鱼腥藻和蛋白小球藻的富藻山楂栽培技术模式探索。试验证明，该模式不仅可以显著增加山楂产量、不饱和脂肪酸含量及糖度，还可降低山楂的农残，使该山楂品质从根本上区别于其他地区，这对于打造县域特色山楂品牌、提升农产品地理标志的品牌价值和产业竞争力具有重要意义。

1生物技术的载体选择研究

微藻是指一类富含叶绿素α并且能够进行光合作用的微生物的总称，微藻可以吸收稻田污水中的重金属、无机盐，且可降解农药、酚类、烷类等有机物[4]。其研制利用工作早在20世纪40年代，已在美国、日本、德国和以色列等国开展。世界上有100万种藻类，已知的微藻有40 000余种。目前使用生物技术大量种植或生产的微藻有普通小球藻、蛋白核小球藻、固氮蓝藻、鱼腥藻等，在山楂绿色生产上，可以根据其自有特性加以利用。

1.1固氮鱼腥藻

1.1.1选择依据固氮鱼腥藻细胞超强的生物固氮作用（N2+8e-+16MgATP+8H+→2NH3+H2+16 MgADP+ 16Pi）[5]是固氮鱼腥藻固氮方式，它含有的固氮酶能固定大气中的分子态氮，合成氨基酸和蛋白质，从而减少植物对氮素肥料10%～30%的需求；能够溶解土壤中固定的磷（Ca3（PO4）2 +CnOnH=H++2PO43-+CnOn-+ 3Ca2+）以及细胞分泌物浸入网格内活化钾离子供给植物直接吸收，防止与土壤中的其他元素形成拮抗，又能活化土壤中的中量元素与各种微量元素，并输送到植物根系，促进吸收；其细胞外有丰富的多糖类胶质EPS，并含生长刺激物质，可以改良土壤，提高土壤的保肥、保水能力。

1.1.2作用机制固氮鱼腥藻细胞的反向载体系统是指物质跨膜运动的方向与离子转移的方向相反，即载体在与H+结合后再与其他分子或离子（如Na+）结合，两者朝相反方向通过细胞膜进行运输。反向载体系统的主要作用一方面是促使Na+流出，减少Na+累积，以增加蓝藻对于盐分环境的耐受性；另一方面反向载体系统不断将胞外H+摄入胞内，以调节细胞内的pH值的平衡。

1.2蛋白小球藻

1.2.1选择依据蛋白小球藻是世界上地表面积最大微生物[6]，被科学界称为“罐装的太阳”。能够利用微光和弱光进行光合作用，超过植物自身光合作用的数十倍。它能够大大提高植物有机物质的积累，提供丰富、均衡的天然营养素和促进植物体对水分的利用。同时迅速吸附各种重金属离子并促进植物体将有害物质排出体外；其特有的活性因子修复受损细胞、激活吞噬细胞和干扰素，诱导植物抗性，还能降解土壤中的农药化肥残留并转化为对植物有益的可利用态。

1.2.2作用机制小球藻进行光合作用机制为CO2+ H2O=（CH2O）+O2（条件酶、叶绿素）（图1）。同时，蛋白小球藻使吞噬细菌或病毒的网内细胞作用十分活跃，是有害物质的直接利用者，可以降低山楂中的氨氮、亚硝酸盐的含量。蛋白小球藻细胞对山楂体内不同形态氮的去除能力顺序为：氨氮>硝酸盐态氮>亚硝酸盐态氮。对不同形态磷的去除能力顺序为：正磷酸盐>偏磷酸盐>焦磷酸盐>有机磷酸盐[7]。

1.2.3动力学研究“耕地重金属严重污染”是当前我国需要解决的现实问题之一。农用地土壤污染状况详查结果显示，影响农用地土壤环境质量的主要污染物是重金属，其中镉为首要污染物。对小球藻的吸附动力学研究表明：蛋白小球藻细胞壁的化学组成成分在重金属吸附功能上有明显优势。细胞在生长过程中会不断向周围环境中释放多种代谢产物，如碳水化合物、氨基酸、酶类、维生素、有机磷酸、毒素、挥发性物质以及抑制和促进因子等。通过示踪实验发现，由蛋白小球藻细胞固定的碳至少有5%以DOC形式释放到水体中及土壤中，条件好时藻类释放DOC高达10%～25%。蛋白小球藻细胞对重金属吸附能力的大小依次为：铜>锡>镉>镍>铅>钴[ 8 ]，通过主动吸附、被动吸附两种方式，对重金属离子吸附钝化，从而实现解决土壤重金属污染问题的目的。

2基于固氮鱼腥藻和蛋白小球藻的富藻山楂技术应用原理

2.1细胞裂变增氧原理

两种细胞进入到土壤后会无性繁殖，并成几何形裂变，一个细胞会在土壤中裂变成亿万个细胞，细胞源源不断地释放氧气，土壤通过细胞的裂变繁殖使土壤增氧通气从而使土壤里的原本有益的微生物大量繁殖，同时抑制厌氧菌活性；增加有机质，通过细胞的生命活动将土壤带回到原始的状态。从根本上解决土壤板结、残留等问题，从而保证了农产品的天然有机、无毒无害的本质。

2.2养分均衡原理

基于固氮鱼腥藻和蛋白小球藻的富藻山楂种植模式为山楂提供有机氮源，并溶磷、解钾及活化土壤里的中量、微量元素，促进山楂快速生长，帮助山楂积累养分。在有效促进光合作用的同时，为山楂生长持续地提供全面均衡的养分，产生的有机物质能有效调节土壤酸碱度，使其逐渐趋于中性[9]。活性细胞拥有趋光性和趋化性，进入土壤后通过细胞大量的裂变繁殖，改善土壤通气性、透水性。

2.3代谢提升原理

萜类物质广泛存在于自然界中，可以有效提高植物生长代谢中的生理活性。基于固氮鱼腥藻和蛋白小球藻的富藻山楂种植模式可以通过异戊二烯焦磷酸酯的途径协助激发植物次生代谢，从而产生萜类聚合物。这对提高植物抗病、抗旱、抗涝、抗寒、抗重茬等抗逆性和山楂内在品质有着正向作用。应用在山楂上可延长农产品货架期（主要原理为干物质丰富、可溶性固形物增加），使山楂外在品相颜色亮丽，大小均匀。

3山楂实验生物肥厂家选择和生物技术

运城生物科技发展有限公司是集藻类活性细胞生物肥研发、生产、销售为一体的高科技公司——微藻生物时代（吉林）生态科技有限公司在运城设立的子公司，其在固氮生物产品的研发与应用方面居于国内领先地位，并拥有母细胞提取、培养基和细胞包埋三项核心技术。其藻类活性细胞复合生物肥的研制与应用技术于2014年经农业部科技发展中心评价达到“国内领先”水平，并被农业部列为2015年主推技术。其固氮鱼腥藻和蛋白小球藻生物肥生产采用了单一细胞快速扩繁技术，固氮鱼腥藻和蛋白小球藻分别在显微镜下提取并作细胞结构学分析，选取符合要求的最优单细胞链作为母细胞链，分别在试管中培养5～10天，然后接种到100毫升瓶中，培养5～10天，再接种到1升三角瓶中，培养5～10天，再接种到5升三角瓶中，培养5～10天，再接种到18升桶中培养10～ 20天，最后接种至1吨大桶中培养20～100天，整个过程逐级扩大培养，持续光照和恒温，在培养过程中水和空气都要经过过滤和净化达到标准，最后生物肥含量中的固氮鱼腥藻和蛋白小球藻分别达到800万个/毫升。

4闻喜县基于固氮鱼腥藻和蛋白小球藻的富藻山楂种植试验

4.1试验地点及农户信息

山西省闻喜堆后村（闻喜县半山腰山楂种植专业合作社试验田）李玉仙果园，联系电话：13834397137。

4.2试验设计

试验组固氮鱼腥藻和蛋白小球藻处理，对照组按照闻喜山楂管理规程正常管理。试验结束后通过土壤分析和品质分析进行对比。为确保试验结果的可靠性，在整个生长过程中，土壤耕作除草、灌水、病虫害防治都要正常进行。

山楂试验设1个处理，1个对照，3次重复。每个处理面积1亩。土壤试验设1个处理，1个对照，3次重复。每个处理面积1亩。

每个处理和对照，按东、西、南、北、中分别取一棵山楂树上所有山楂果实进行糖度、多不饱和脂肪酸含量和优质果率进行测算，每个处理和对照，按东、西、南、北、中分别取一棵山楂树下土壤（1000厘米3）进行分析。

4.3试验材料

闻喜县堆后村大金星山楂、闻喜山堆后村山楂种植园土壤。固氮鱼腥藻和蛋白小球藻生物肥由运城地福来生物科技有限公司提供，经过单一细胞快速扩繁技术，固氮鱼腥藻和蛋白小球藻分别达到800万个/毫升（图2～图4）。

4.4试验处理类别

4.4.1山楂处理固氮鱼腥藻和蛋白小球藻+70%常规施肥，8月1日一次，使用固氮鱼腥藻和蛋白小球藻各200毫升。对照为常规施肥。

4.4.2土壤处理固氮鱼腥藻和蛋白小球藻+70%常规施肥，8月1日一次，使用固氮鱼腥藻和蛋白小球藻各400毫升。对照为常规施肥。

4.5结果与分析

从表1中可以得出，施用各200毫升固氮鱼腥藻和蛋白小球藻的山楂，其多不饱和脂肪酸相较对照组增加4.1毫克/100克，糖度比对照组增加1.8个百分点。

从表2中可以得出，各施用400毫升固氮鱼腥藻和蛋白小球藻的土壤，其有机质含量都得到提升，增加0.18个百分点。

5绛县山楂基于固氮鱼腥藻和蛋白小球藻的富藻山楂种植模式试验效果

5.1试验地点及农户信息

山西省绛县郑柴村刘善福果园，联系电话

13934396508。

5.2试验材料

绛县郑柴村大金星山楂、绛县郑柴村山楂种植园土壤。固氮鱼腥藻和蛋白小球藻，由运城地福来生物科技有限公司提供，经过单一细胞快速扩繁技术，固氮鱼腥藻和蛋白小球藻分别达到800万个/毫升（图5～图8）。

5.3试验设计

山楂试验设2个处理，1个对照，3次重复。每个处理面积1亩。土壤试验设2个处理，1个对照，3次重复。每个处理面积1亩。为确保试验结果的准确性，在整个生长过程中，土壤耕作除草、灌水、病虫害防治都要正常进行。

每个处理和对照，按东、西、南、北、中分别取一棵山楂树上所有山楂果实进行糖度、多不饱和脂肪酸含量和优质果率进行测算，每个处理和对照，按东、西、南、北、中分别取一棵山楂树下土壤（1000厘米3）进行分析。

山楂处理：（1）处理1：固氮鱼腥藻和蛋白小球藻+70%常规施肥，7月6日一次，使用固氮鱼腥藻和蛋白小球藻各200毫升。（2）处理2：固氮鱼腥藻和蛋白小球藻+70%常规施肥，7月6日一次，使用固氮鱼腥藻和蛋白小球藻各400毫升。（3）对照：常规施肥。

土壤处理：（1）处理1：固氮鱼腥藻和蛋白小球藻+70%常规施肥，7月6日一次，使用固氮鱼腥藻和蛋白小球藻各200毫升。（2）处理2：固氮鱼腥藻和蛋白小球藻+70%常规施肥，7月6日一次，使用固氮鱼腥藻和蛋白小球藻各600毫升。（3）对照：常规施肥。