斜带石斑鱼源的哈维氏弧菌分离与鉴定

摘要 ［目的］为鉴定造成湛江某养殖场斜带石斑鱼大量死亡的病原，对皮肤滋生白色隆起疥疮的患病斜带石斑鱼进行解剖与细菌分离与纯化。［方法］通过生化反应、16S rRNA基因克隆与测序，构建系统进化树鉴定分离纯化获得的优势菌S1。采用OD600和平板活菌计数绘制V.harveyi S1生长曲线，以R2判断其生长曲线的相关性和可信度。［结果］鉴定结果显示S1为哈维氏弧菌，同V.harveyi hq-V149聚为一支。药敏试验结果显示，斜带石斑鱼源的哈维氏弧菌S1对诺氟沙星、头孢氨苄、左氧氟沙星、环丙沙星等12种抗生素敏感，对青霉素G、氨曲南、链霉素、头孢唑林、头孢哌酮等12种抗生素不敏感。［结论］哈维氏弧菌S1是造成湛江某养殖场斜带石斑鱼大量死亡的病原，其指数生长时间为5～12 h，随后进入平台期。

关键词 哈维氏弧菌；16S rRNA；斜带石斑鱼；药敏试验；生长曲线

中图分类号 S 94  文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2025）02-0071-06

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2025.02.017

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Isolation and Identification of Vibrio harveyi from Epinephelus coioides

XU Lu-xi，GU Hao-ming，XU Xin-lan et al

（Guangdong Ocean University， Zhanjiang，Guangdong 524000）

Abstract ［Objective］To identify the pathogen that caused deaths of Epinephelus coioides in a farm in Zhanjiang，conducted the dissection of Epinephelus coioides with white raised scabies on skin，and bacterial isolation and purification.［Method］Though biochemical reactions，16S rRNA gene cloning and sequencing，a phylogenetic tree was constructed to identify the dominant strain S1.The growth curve of V.harveyi S1 was plotted by OD600 and plate viable count.According to R2，it would determine the correlation and reliability of its growth curve.［Result］The identification result showed that S1 is one of Vibrio harveyi，the same as V.harveyi hq-V149 converged into one branch.The drug sensitivity test results showed that Vibrio harveyi S1 was sensitive to 12 antibiotics such as norfloxacin，cephalexin，levofloxacin and ciprofloxacin，but not to 12 antibiotics such as penicillin G，amtreonam，streptomycin，cefazolin and cefoperazone.［Conclusion］Vibrio harveyi S1 is the pathogen which caused deaths of Epinephelus coioides in a farm in Zhanjiang.The exponential growth time of S1 is 5-12 hours，and then enters the plateau period.

Key words Vibrio harveyi;16S rRNA;Epinephelus coioides;Drug sensitivity test;Growth curve

斜带石斑鱼（Epinephelus coioides）又称青斑，是鲈形目鮨科下石斑鱼属物种，作为海水养殖代表物种之一，同大黄鱼、金枪鱼等经济物种一样具有高经济价值。人工养殖石斑鱼已有20多年历史^［1］ ，国内石斑鱼养殖多集中在广东、海南、福建。随着养殖技术的提高和养殖规模的扩大，养殖产量稳步提升，2017年石斑鱼养殖产量超过捕捞产量，其中广东养殖规模最大，到2022年广东地区石斑鱼年产量达到93 024万t，占全球养殖规模的45.57%。然而种质的退化、环境的污染以及超出环境容量的养殖密度导致石斑鱼病害频发，2021年广东水产养殖中有约50%的经济损失由病害造成^［2］。

石斑鱼最主要的养殖模式是海水网箱养殖，其次是池塘养殖和工厂化养殖^{［ 3］}。高密度、高污染的养殖过程中出现的富营养化造成水体中细菌群落结构与功能的变化，在海洋中广泛分布的弧菌已经成为海洋养殖的主要病原之一^［4］ 。部分病原性弧菌能跨物种感染，弧菌中的哈维氏弧菌正是能跨物种感染的病原弧菌之一^［5-9］。

哈维氏弧菌能感染鱼类^{［5，10-11］}、虾类^［7，12］和贝类^［6］，甚至能感染海马^［13］，患病动物源自天津、广东、海南等多地。在石斑鱼上，持续报道患病石斑鱼体内分离出哈维氏弧菌^［14-16］。而在斜带石斑鱼上，早在2004年，便有从患病斜带石斑鱼肝脏分离出哈维氏弧菌的报道^［17］，2021年又有斜带石斑鱼源哈维氏弧菌分离报道^［18］。哈维氏弧菌跨物种感染能力之强，地理分布之广，病害泛滥时间之久^［19］，都证明其作为病原对石斑鱼养殖的负面影响之大。

近期，湛江某养殖场斜带石斑鱼发病，出现鱼体体表发黑、溃烂现象，同时伴有白色隆起疥疮滋生。为研究其病因，笔者对该养殖场发病斜带石斑鱼进行致病菌分离、纯化，观察其形态特征。后通过分子技术和生理生化反应进一步对该分离菌株进行鉴定，确认其中优势株S1为哈维氏弧菌，并根据16S rRNA基因序列多序列比对结果以Neighbor-Joining法构建斜带石斑鱼源哈维氏弧菌S1的系统进化树，确认哈维氏弧菌S1的进化地位。同时绘制哈维氏弧菌S1的生长曲线，检测哈维氏弧菌S1的耐药性。以期为后续对哈维氏弧菌S1的深入研究提供基础，为探寻斜带石斑鱼养殖过程哈维氏弧菌防治提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

于湛江某养殖基地取样3条（5.52±0.20） cm，患病斜带石斑鱼分别标记为Ec 1、Ec 2、Ec 3。一次性涂布棒、16S通用引物、微量细菌生化反应管（购自杭州滨和微生物试剂有限公司）、药敏纸片（购自杭州滨和微生物试剂有限公司）、TSA 琼脂培养基、LB 琼脂培养基、TCSB 琼脂培养基、LB培养基、TSB 培养基。

1.2 试验方法

1.2.1 鱼病诊断。对Ec 1、Ec 2、Ec 3进行目检和剖检，将检查结果与健康斜带石斑鱼进行比较，记录病变组织和组织结构上的病理变化。

根据检查结果对病原进行初步判断。

1.2.2 细菌分离与纯化。

对Ec 1、Ec 2、Ec 3体表病灶（Sk）、肝脏（Li）、脾脏（Sp）3个出现病理变化的部位在TSA 平板、LB平板、TCSB平板划线接种，接种平板于28 ℃培养箱中培养18 h，观察平板上菌落的大小、颜色和形态并记录，挑取固体培养基上不同区域一定数量的单菌落于LB液体培养基，37 ℃摇床振荡培养12 h。在菌液中添加等体积浓度为40%的灭菌甘油，于-80 ℃保存。

1.2.3 16S rRNA基因序列克隆与分析。

以1∶100的比例，将“1.2.2”中分离纯化的菌液接种于400 μL LB液体培养基，于37 ℃振荡培养6 h，通过细菌全基因组DNA提取试剂盒提取细菌DNA后对其16S rRNA进行基因克隆、测序与分析，对细菌进行鉴定，引物分别为：27F（AGAGTTTGATCCTGGCTCAG）和1492R（GGTTACCTTGTTACGACTT）。PCR体系为20 μL：1 μL模板、1 μL上游引物、1 μL下游引物、7 μL ddH2O、10 μL 2× SanTaq PCR Mix预混液［生工生物工程（上海）股份有限公司］，35个循环。通过1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物并于紫外光下确认产物大小符合预期，寄送至生工生物工程（广州）股份有限公司进行双向测序，并对测序结果进行分析。

1.2.4 生化鉴定。

无菌条件下，取100 μL S1菌液在TSA 平板上划线涂板，于28  ℃下培养12 h，取单菌落接种在微量生化反应管中，将微量生化反应管放置28 ℃培养18～24 h，根据杭州滨和微生物试剂有限公司《细菌微量生化反应管说明书》确认S1细菌生化反应结果。通过《伯杰细菌鉴定手册》《常见细菌鉴定手册》对S1生化特性进行鉴定。

1.2.5 药敏试验。

在无菌条件下制备10个TSA 平板，每个平板均匀涂布100 μL菌液，等距平贴3张药敏纸片。以3个不同角度测量每个抑菌环直径，最后取3次测量的平均值，长度单位mm，记录在册，整理并以《NCCLS药敏试验标准》和杭州滨和微生物试剂有限公司《抗生素类药敏纸片使用说明书》为标准判断药敏试验结果^［12］。

1.2.6 细菌生长曲线绘制。

在无菌条件下接种哈维氏弧菌至装有5 mL TSB培养基的试管中，于28 ℃培养12 h；再以1∶100比例接种菌液于装有100 mL TSB培养基的锥形瓶，于28 ℃培养；选择不同时间点（0、0.5、1.5、2.5、3.0、5.0、6.5、8.0、12.0、16.0、20.0和24.0 h），收集菌液，在无菌条件不同稀释倍数下（×105、×107、×109和×10¹¹倍）涂布在TSA平板上，于28 ℃培养箱中培养12 h后计数，有效计数范围为10～200。同时通过分光光度计在波长600 nm条件下测量该时间点的OD 600值，菌液浓度较高时，将菌液稀释至OD600值在0.4～0.6区间再进行测量，测量结果乘稀释倍数，记录在册。

2 结果与分析

2.1 鱼病诊断结果

对Ec 1、Ec 2、Ec 3 3条患病斜带石斑鱼进行目检，发现其均体表变黑，严重溃烂并出现不规则的白色隆起疥疮。Ec 1背鳍相对完好，尾鳍开始溃烂，胸部和尾部有充血。Ec 2头部和胸部有白色疥疮，尾鳍有溃烂，嘴部充血。Ec 3体表出现大量不规则白色疥疮，还出现了淡黄色结节，尾鳍和背鳍完全溃烂。