安徽鸡群鸡滑液囊支原体病流行病学调查与病原分离鉴定
作者： 侯宏艳 沈学怀 赵瑞宏 胡晓苗 戴银 尹磊 殷冬冬 王洁茹 郝胜杰 潘孝成
摘要 为进一步了解鸡滑液囊支原体（Mycoplasma synoviae，MS）在安徽鸡群中的感染情况和流行菌株的遗传进化特征，对10个不同类型鸡群进行血清学和抗原核酸检测，分离并鉴定菌株，并进行遗传进化分析。结果表明，安徽鸡群中MS的平均抗体阳性率为71.02%，平均核酸阳性率为72.19%，血清学检测结果和核酸检测结果之间存在显著相关（P<0.05）；通过不同类型鸡群的比较发现，青年鸡群MS的感染率最低，其次为种鸡群。经过分离、培养、纯化和鉴定，从发病鸡群中分离到2株MS分离株，命名为AHH-01和AHH-02，分离株具有典型的MS菌株特征；基因分型结果显示，2株分离株均为K基因型，在遗传进化关系上与四川分离株SMU-SCYA-LF1/2019的亲缘关系最近，与国内其他地区的分离株存在一定的遗传距离。该研究为深入分析安徽地区鸡群MS的感染情况和流行菌株提供了研究基础。
关键词 鸡滑液囊支原体；血清学；核酸；分离鉴定；进化分析
中图分类号 S858.31 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2025）03-0082-04
doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2025.03.016
开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
Epidemiological Survey and Pathogen Isolation，Identification of Mycoplasma synoviae in Chicken Flocks in Anhui
HOU Hong yan1，2， SHEN Xue huai1，2，3，ZHAO Rui hong1，2 et al
（1.Institute of Animal Husbandry and Veterinary Science， Anhui Academy of Agricultural Sciences/Anhui Provincial Key Laboratory of Livestock and Poultry Product Safety， Hefei， Anhui 230031; 2.Research and Development Center of Livestock and Poultry Disease Prevention and Control Technology， Institute of Advanced Research，Anhui Academy of Agricultural Sciences， Hefei， Anhui 230031; 3.College of Veterinary Medicine， Nanjing Agricultural University， Nanjing， Jiangsu 210095）
Abstract In order to further understand the infection status and genetic evolutionary characteristics of Mycoplasma synoviae （MS） in chicken flocks in Anhui， serological and antigenic nucleic acid tests were performed on 10 different types of chicken flocks. The strains were isolated and identified， the genetic evolutionary analysis was made. The results showed that the average antibody positive rate of MS in chicken flocks of Anhui was 71.02% and the average nucleic acid positive rate was 72.19%， with a significant correlation between the serological results and nucleic acid detection results （P<0.05）. Through the comparison among different types of flocks， it was revealed that the infection rate of MS was the lowest in young flocks， followed by breeder flocks. Through the isolation， culture， purification and identification， two MS isolates were isolated from the diseased chicken， named AHH 01 and AHH 02. The isolated strains had the typical characteristics of MS strains. The genotyping results showed that the two isolates were all K genotype， which had the closest genetic relationship with the isolate SMU SCYA LF1/2019 from Sichuan， and a certain genetic distance from the isolates in other regions of China. This study provided the basis for in depth analysis of MS infection and prevalent strains in chicken flocks in Anhui.
Key words Mycoplasma synoviae；Serology;Nucleic acid; Isolation and identification；Evolutionary analysis
基金项目 安徽省重点研究与开发计划项目（202204c06020039）；国家蛋鸡产业技术体系项目（CARS-40）；安徽省农业科学院平台项目（2024YL016）；安徽省家禽产业技术体系项目（AHCYJSTX-06）。
作者简介 侯宏艳（1975—），女，河南浚县人，助理研究员，硕士，从事畜禽病原学研究。
*通信作者：沈学怀，副研究员，博士，从事畜禽传染病研究；潘孝成，副研究员，博士，从事畜禽传染病研究。
收稿日期 2024-06-03；修回日期 2024-07-24
鸡滑液囊支原体（Mycoplasma synoviae，MS）感染不同日龄阶段的鸡从而引发鸡滑液囊支原体病（Mycoplasma synoviae disease）。该病主要造成病鸡关节肿大、滑膜囊及肌腱炎症、呼吸道症状以及鸡蛋顶端异常，严重威胁鸡群健康和经济效益［1］。该病在世界范围内流行，多个国家的流行病学监测表明MS在商品代鸡群中有很高的流行率［2-3］。我国最早关于MS感染的报道是一些地区肉鸡群出现“腿瘫病”，随后在蛋鸡和种鸡中也出现类似疾病，最终被确认是由MS感染引起的。自2010年以来，以滑膜炎为主要特征的鸡群MS感染在我国广泛流行［4］。Sun等［5］对16个省份采集的鸡血清进行检测，发现抗体阳性率达63.2%。2012—2014年江苏部分地区鸡腿瘫病病例病原检测结果表明MS感染占48.75%，是引起鸡“腿瘫病”的主要病因［6］。
近年来，随着MS在鸡群中的广泛流行，不同品种的感染鸡群除了出现典型的临床症状外，还能造成鸡群产蛋率下降，并伴有蛋壳顶端异常等非典型病理变化［7］。当前，国内有不少学者利用ELISA血清试验和病原PCR检测进行MS流行病学调查。沈学怀等［8］对安徽部分鸡场的MS感染调查显示，鸡场MS阳性率为90.48%，平均血清阳性率为77.01%。国内有学者从鸡群中分离和鉴定出多株MS毒株［9-10］，表明MS在国内鸡群中广泛流行。MS虽然只有一个血清型但有多个基因型，可变脂蛋白血凝素A基因（vlhA）被广泛应用于MS的基因型鉴定［11］。笔者对安徽部分鸡群进行MS感染的血清学和病原核酸检测，从具有明显临床症状的鸡群中分离培养出2株MS流行株，并对其基因型和进化背景进行分析，以期为鸡群MS感染的防控和净化提供基础数据。
1 材料与方法
1.1 主要试剂
MS抗体ELISA检测试剂盒、MS DNA荧光PCR检测试剂盒均购自IDEXX公司；不含结晶紫的PPLO肉汤培养基和PPLO琼脂培养基均购自青岛海博生物技术有限公司；核酸提取试剂盒为西安天隆科技有限公司产品；2×PCR PreMix、琼脂糖等均购自宝生物工程（大连）有限公司。
1.2 MS阳性血清的制备
使用鸡滑液囊支原体标准菌株CVCC2960免疫4周龄SPF鸡14 d后重复免疫1次，二免后21 d心脏采血，离心，制备血清。
1.3 样品采集与来源鸡场
对安徽3个种鸡群、2个青年鸡群和5个蛋鸡群采取随机抽样的方式采样，使用一次性真空采血管翅下静脉采集2 mL血液，室温静置30 min，5 000 r/min离心10 min后收集血清，置于-20 ℃下保存。采用无菌棉签采集鸡腭裂拭子，并将拭子样品置于含1.0 mL生理盐水的EP管中，-20 ℃冰箱保存。对种鸡群2和蛋鸡群1中出现胸骨囊肿和关节肿胀的病鸡，采集其关节腔内容物，用于MS的分离与培养。种鸡群2为245日龄，出现零星死亡，高峰产蛋率在90%左右；蛋鸡群1为300日龄，个别鸡只跗关节肿大，高峰产蛋率约80%。
1.4 试验方法
1.4.1 MS血清抗体检测。所有鸡场血清样品MS抗体检测步骤和结果判定均按照检测试剂盒说明书操作。群体阳性率计算公式：群体阳性率=（阳性数/总样品数）×100%。
1.4.2 MS核酸检测。将装有腭裂拭子的EP管在涡旋振荡器上5 000 r/min剧烈振荡1 min，使拭子上的样品充分分散到生理盐水中；取400 μL样品加到核酸提取试剂盒的加样孔中，采用自动核酸提取仪的提取程序获得样品DNA。MS荧光PCR反应体系（25 μL）如下：10 μL引物和探针预混液、10 μL扩增液、5 μL DNA样品。荧光PCR反应程序如下：50 ℃ 15 min；95 ℃ 1 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s（收集荧光），共45个循环。另设置阴性对照和阳性对照。
1.4.3 菌株的分离与纯化。病原分离的培养基为改良的Thiaucourt’s培养基。无菌采集病鸡关节腔内容物，并加入少量液体培养基进行匀浆，组织悬液在液体培养基中37 ℃恒温培养 5～7 d后，连续10倍梯度稀释至10-3后继续培养5～7 d。每一代培养物都用0.45 μm滤器过滤后进行传代培养。当培养基变黄时，将培养物转接于固体平皿培养基中，置于 37 ℃下培养4～5 d。待培养基出现特征性菌落后，再转接入液体培养基中，重复2～3次，获得支原体纯化培养物。