微生物发酵制备红景天香原料及其特征成分分析

摘要 ［目的］利用酿酒酵母发酵制备红景天香原料，并分析其特征成分。［方法］红景天粉末经超声提取、灭活、接种酿酒酵母种子液、发酵、一次醇提和过滤、二次醇提和过滤、浓缩等步骤得到天然香原料。建立UPLC-MS/MS方法对该香原料中红景天苷、酪醇、络塞维、红景天素、槲皮素5种成分进行定量分析，探讨酿酒酵母糖基转移酶（UGT）在红景天苷合成中的作用。［结果］制备所得红景天香原料具有浓郁芳香气味，与对照样品相比，红景天苷含量提高了14.8%，酪醇含量提高了11.7%，络塞维、红景天素、槲皮素含量增加不明显。［结论］该研究利用微生物发酵技术结合化学成分检测和qPCR技术，制备了安全稳定、活性成分含量较高的天然香原料，为其在食品添加剂、烟草、日化等领域的应用提供理论依据。

关键词 微生物发酵；红景天；UPLC-MS/MS；天然香原料；特征成分

中图分类号 R284  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2025）03-0163-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2025.03.034

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Preparation of Rhodiola Perfume by Microbial Fermentation and Analysis of Its Characteristic Components

SONG Kai， LIU Chen， ZANG Zhi peng et al

（Technology Center， Gansu Tobacco Industry Co.， Ltd.， Lanzhou，Gansu 730050）

Abstract ［Objective］To prepare Rhodiola perfume by fermentation with Saccharomyces cerevisiae and analyze its characteristic components.［Method］Rhodiola powder underwent ultrasonic extraction， inactivation treatment， inoculation of Saccharomyces cerevisiae seed solution， fermentation， primary alcohol extraction and filtration， secondary alcohol extraction and filtration， concentration， and other steps to obtain natural aroma raw materials. UPLC MS/MS method was established to quantitatively analyze the five components of salidroside， tyrosol， rosavin， rhodiosin and quercetin in the raw materials. The role of Saccharomyces cerevisiae glycosyltransferase （UGT） in salidroside synthesis was investigated.［Result］The prepared Rhodiola rosea perfume had a strong aromatic aroma. Compared with the control sample， the content of salidroside increased by 14.8%， the tyrosol content increased by 11.7%， and the content of rosavin， rhodiosin and quercetin did not increase significantly.［Conclusion］The microbial fermentation technology combined with chemical composition detection and qPCR technology were used to prepare safe and stable natural aroma raw materials with high content of active ingredients， which provided theoretical basis for their application in food additives， tobacco， daily chemical and other fields.

Key words Microbial fermentation;Rhodiola;UPLC MS/MS;Natural perfume;Characteristic component

作者简介 宋凯（1990—），女，甘肃兰州人，工程师，硕士，从事分析化学研究。*通信作者，工程师，硕士，从事烟草微生物学、烟草化学研究。

收稿日期 2024-03-20

红景天（Rhodiola）为景天属多年生草本植物，具有抗疲劳、抗抑郁、抗衰老、抗氧化、抗辐射等药用功能^［1-2］，其主要有效成分为苷类和黄酮类化合物^［3］。苷类化合物主要包括红景天苷、酪醇、苯丙素类（洛塞琳、络塞维、洛塞等）^{［4 -6］}。红景天苷被认为是红景天中最具药用价值的功能性成分，具有抗氧化、抗炎、抗肝纤维化等作用，其含量的高低通常作为评价红景天药效的重要因素^［7-8］。黄酮类化合物主要包括红景天素、槲皮素以及它们的衍生物^［9］。目前红景天理论研究主要集中于生物功能和药理活性，应用研究主要集中于药物、保健品、护肤品等方面^［10-14］，近年来因其提取物香气丰富、香调独特、抗氧化抗辐射等特点，应用领域逐渐扩展到烟草行业作为烟用添加剂使用^［15-16］。

红景天香原料多为以化学方法制备的浸膏、精油、提取物、提取液、固体粉末等^［17］，工艺较复杂且有机试剂使用率较高。利用微生物技术制备红景天香原料，同时将发酵产物中特征成分红景天苷、酪醇、络塞维、红景天素、槲皮素作为关键指标进行检测，以验证发酵效果的研究鲜有报道。该研究结合相关文献，建立了高效、高灵敏度和高选择性的UPLC-MS/MS分析方法，对酿酒酵母发酵制备得到的红景天香原料进行定量分析，并对酿酒酵母糖基转移酶（UGT）在红景天苷合成中的作用进行研究，为其在香精香料领域的应用提供了理论和技术支持。

1 材料与方法

1.1 试材与试剂

红景天苷（纯度≥98%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；酪醇（纯度≥98%，美国Sigma-Aldrich公司）；络塞维（纯度≥98%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；红景天素（纯度≥98%，上海麦克林生化科技股份有限公司）；槲皮素（纯度≥99%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；茶碱（纯度≥98%，北京百灵威科技有限公司）；色谱级甲醇和乙腈（北京百灵威科技有限公司）；色谱级甲酸（北京百灵威科技有限公司）；市售红景天药材。水为实验室自制一级水。菌株为酿酒酵母（保藏编号CICC No.1394）；培养基为PDA培养基。

1.2 仪器

Agilent 1290 UPLC- Ultivo三重四极杆质谱仪（美国安捷伦科技有限公司）；万分之一电子天平（北京赛多利斯科学仪器有限公司）；KQ-100E超声清洗器（昆山超声仪器有限公司）；QIAcube核酸提取仪（德国Qiagen有限公司）；Qubit荧光定量仪（美国Thermo Fisher Scientific科技公司）；qPCR仪（德国Qiagen有限公司）；离心机（德国Eppendorf股份公司）。

1.3 红景天香原料的制备

1.3.1

红景天溶液制备。红景天药材低温（≤40 ℃）粉碎过筛，称取1 g粉末与水、葡萄糖按质量比1∶20∶3混合均匀，温度55 ℃、功率500 kW超声提取60 min，121 ℃灭菌30 min，冷却至室温得红景天溶液。

1.3.2

酿酒酵母种子液制备。取酿酒酵母菌株接种于PDA固体培养基，30 ℃下培养5 d，形成酿酒酵母孢子；灭菌玻璃棒从平板上刮取孢子，无菌水稀释，孢子悬浮液的OD600为1.0，得到酿酒酵母种子液，其中酿酒酵母的浓度为2.88×106 CFU/mL。

1.3.3

红景天发酵液制备。将红景天溶液接种酿酒酵母种子液，接种量为红景天溶液体积的1%，发酵时间68 h，摇床转速178 r/min，发酵温度28 ℃，发酵后得到红景天发酵液。

1.3.4 红景天发酵液的提取及浓缩。

1.3.4.1

提取。上述所得红景天发酵液与浓度为75%（V/V）的乙醇按照体积比1∶10混合，进行一次醇提；采用孔径为60目的滤布过滤，10 000 r/min离心10 min，去除红景天残渣和酿酒酵母菌体后，发酵液与浓度为90%（V/V）的乙醇按1∶10比例混合，进行二次醇提，采用膜孔径为200目的过滤膜进行过滤得到红景天提取液。

1.3.4.2

浓缩。采用旋转蒸馏真空减压法浓缩，浓缩温度30 ℃、真空度35 hPa，转速75 r/min，将红景天发酵提取液减压浓缩至平均密度为1.20 g/mL，得红景天香原料。

1.4 红景天香原料特征成分分析

1.4.1 供试品溶液分析。取100 μL按照“1.3”制备的红景天香原料，加入50 μL内标溶液，用甲醇稀释至10 mL，0.22 μm有机相滤膜过滤待UPLC-MS/MS分析。

1.4.2

对照样品分析。对照样品为按照“1.3”步骤不发酵、同等工艺条件下制备的红景天香原料。处理方式同“1.4.1”，0.22 μm有机相滤膜过滤待UPLC-MS/MS分析。

1.5 标准溶液制备

分别称取红景天苷、酪醇、络塞维、红景天素、槲皮素0.05 g（精确至0.1 mg）于100 mL容量瓶，甲醇溶解并定容作为标准储备液。分别量取储备液4、10、20、40、100、200、400、1 000、2 000 μL，加入内标茶碱溶液（0.1 mg/mL）500 μL，加甲醇定容至100 mL制得20、50、100、200、500、1 000、2 000、5 000、10 000 ng/mL红景天系列标准溶液。标准溶液总离子流色谱图如图1所示。

1.6 检测条件

1.6.1

色谱条件。色谱柱为ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱（3.0 mm×50 mm，1.8 μm）。流动相A为2 mmol/L乙酸铵水溶液，B为0.5%甲酸-甲醇溶液，梯度洗脱程序如表1所示；流速0.3 mL/min；柱温35 ℃；进样量1 μL，进样时间8 min。

1.6.2 质谱条件。离子源为AJS ESI源；干燥气温度250 ℃；干燥气体流速7.0 L/min；喷雾气压力206.84 kPa；鞘气（N2）温度325 ℃；鞘气（N2）流速11.0 L/min；毛细管电压3 500 V。扫描方式为MRM 模式，检测方式为负离子检测。5 种待测化合物及内标茶碱质谱参数见表2。

2 结果与分析

2.1 方法学考察

2.1.1

线性关系考察。将“1.5”中系列标准溶液按“1.6”条件分析，以样品浓度与内标浓度比值为横坐标、样品峰面积与内标峰面积比值为纵坐标进行线性回归，以信噪比（S/N）为3和10时的进样浓度为检测限（LOD）和定量限（LOQ）。各组分的回归方程、线性范围、LOD和LOQ见表3。