铜和乙烯对花生反式白藜芦醇合成相关6种转录因子的影响
作者： 包学锋 董旋 蒋春姬 金兰淑 林国林
摘要 ［目的］确定铜离子和乙烯处理下抗逆境转录因子。［方法］采用液相色谱方法测定铜离子和乙烯不同处理下反式白藜芦醇含量，再对相应浓度处理下的材料进行RNA转录组序列测定。［结果］无光照培养条件下的花生幼芽，0.1 mmol/L铜离子处理下花生幼芽生成反式白藜芦醇含量为668.4 ng/g，5 mmol/L乙烯处理下花生幼芽生成反式白藜芦醇含量为5.52 ng/g，铜离子和乙烯交互处理下反式白藜芦醇含量为52.11 ng/g。通过表达同步法筛选出，bZIP转录因子6个条目，ERF转录因子4个条目，MYB转录因子3个条目，WRKY转录因子3个条目，bHLH转录因子2个条目，NAC转录因子2个条目。［结论］0.1 mmol/L铜离子和5 mmol/L乙烯处理调控了WRKY、AP2/ERF、NAC、MYB、bZIP、bHLH这6种转录因子家族20个基因。
关键词 反式白藜芦醇；转录因子；白藜芦醇合成酶基因；铜；乙烯；花生
中图分类号 S 565.2 文献标识码 A
文章编号 0517-6611（2025）04-0005-06
doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2025.04.002
开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
Effects of Copper and Ethylene on Six Transcription Factors Related to Transresveratrol Synthesis in Peanuts
BAO Xuefeng1，DONG Xuan1，JIANG Chunji2 et al
（1.Xichang College，Xichang，Sichuan 615000;2.Shenyang Agricultural University，Shenyang，Liaoning 110000）
Abstract ［Objective］To determine the stressresistant transcription factors under copper ion and ethylene treatments.［Method］Liquid chromatography was used to determine the transresveratrol content under different copper ion and ethylene treatments，and then determined the RNA transcriptome sequence of the materials under corresponding concentrations.［Result］The peanut buds were cultured without light，and the content of transresveratrol was 668.4 ng/g in the peanut buds treated with 0.1 mmol/L copper ion.The content of transresveratrol produced by peanut sprouts was 5.52 ng/g under the treatment of 5 mmol/L ethylene.Under the interaction treatment of copper ion and ethylene，the transresveratrol content was 52.11 ng/g.By expression synchronization method，6 entries of bZIP transcription factor，4 entries of ERF transcription factor，3 entries of MYB transcription factor，3 entries of WRKY transcription factor，2 entries of bHLH transcription factor and 2 entries of NAC transcription factor were selected.［Conclusion］Twenty genes of 6 transcription factor families，including WRKY family，AP2/ERF family，NAC family，MYB family，bZIP family and bHLH，were regulated by 0.1 mmol/L copper ion and 5 mmol/L ethylene treatment.
Key words Transresveratrol;Transcription factor;Resveratrol synthase gene;Copper;Ethylene;Peanut
基金项目 凉山州科技局项目（22DYYF0186）；攀西特色作物研究与利用四川省重点实验室项目（SZ22ZZ07）。
作者简介 包学锋（1977—），男，蒙古族，内蒙古通辽人，讲师，博士，从事植物次生代谢物合成通路研究。*通信作者，教授，博士，博士生导师，从事植物营养学和植物次生代谢方面的研究。
收稿日期 2024-01-04；修回日期 2024-10-12
白藜芦醇是一种植物次生代谢物，是一种植物体受到生物和非生物胁迫时产生的植物保护素［1-2］。植物在受到外界刺激，体内氧化平衡被打破，产生大量的氧化产物，例如超氧阴离子（O2-）和过氧化氢（H2O2）等自由基。植物为了保护自己的内环境，产生多种抗氧化物质来维持平衡。白藜芦醇是一种很好的抗氧化剂，还具有良好的抗炎和抗肿瘤细胞功效［3-4］。铜、铁、氯等元素是植物生命活动所必需的微量元素［5-7］，然而过量的金属离子会对植物体造成逆境胁迫，此时植物会生成大量的木质素加固细胞壁，过量的金属离子会被黏附在根部，从而阻止大量金属离子侵入［8-10］。另外过量的铜离子刺激会促使花生幼芽产生白藜芦醇［11］。
植物激素可促进植物次生代谢产物，Chung等［12-13］研究表明水杨酸、茉莉酸使反式白藜芦醇苷和反式白藜芦醇含量增高。在乙烯信号转导的过程中，胞内的铜转运蛋白RAN1将铜离子转运到内质网膜上的乙烯受体蛋白［14］。白藜芦醇的生物合成由2个底物（丙二酰辅酶A、对香豆酰辅酶A）和白藜芦醇合成酶参与完成，其中白藜芦醇合成酶基因的启动至关重要。白藜芦醇的合成调节，至少涉及2种MYB转录因子，一种是正调控因子（如MYB11、MYB12），一种是负调控因子（如MYB4）。2种MYB转录因子与基因结合的过程中互相竞争转录因子结合位点［15］。而在MYB转录因子家族中，MYB14和MYB15可以正调控二苯乙烯次生代谢途径，促进白藜芦醇的生物合成，它们与植物的抗病性有关［16］。Bao等［11］研究发现铜和乙烯的不同处理能够诱导花生产生白藜芦醇。目前有关铜和乙烯处理下能够激活白藜芦醇合成酶基因表达的抗逆境转录因子研究鲜见报道，为此，笔者通过转录组FPKM数据的聚类分析，初步鉴定铜离子和乙烯处理下参与调控花生白藜芦醇合成的关键基因及逆境响应相关的转录因子，以期为深入探究铜离子和乙烯处理促进花生合成白藜芦醇的抗逆境转录调控分子机制提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 试材培养 以来自山东省的花生品种海花1号为试验材料。挑选颗粒饱满、大小均一的种子，将这些种子在35 ℃的恒温培养箱中用蒸馏水浸泡8 h［17］，将浸泡过的种子均匀铺放在35 cm×27 cm的培养盘上，并覆盖消毒过的毛巾，使用蒸馏水保持种子湿润。在29 ℃的避光条件下培养3 d 后，选择长度为2～3 cm的花生芽，将其放入装有450 mL水的中型塑料杯中，并覆盖一个种植篮，在无光照且温度维持在25 ℃的条件下继续培养7 d。选用纤维状根的花生芽以及长度在4～5 cm、质量在4～5 g的花生芽作为试验材料［18］。
1.2 处理试验 试验设4个处理，分别是空白对照处理（CK，0 mmol/L CuSO4、0 mmol/L乙烯利）、铜离子处理（Cu，0.1 mmol/L CuSO4、0 mmol/L乙烯利）、乙烯处理（ET，0 mmol/L CuSO4、5 mmol/L乙烯利）和铜离子_乙烯交互处理（Cu_ET，0.1 mmol/L CuSO4、5 mmol/L乙烯利）。每个处理设置3个生物学重复，每个生物学重复中包含6个花生幼芽。处理液浸没花生幼芽根部，在无光条件下恒温（25 ℃）处理48 h。
1.3 样品提取 将经过处理的花生根部剪取后置于液氮中预冷，再利用球磨机在1 700 r/min下研磨15 s，将所得的研磨浆转移至离心管中称重，并加入10 mL的80%甲醇萃取液，轻轻摇动管子予以混合，将其置于280 r/min和40 ℃的恒温摇床中振荡60 min。然后，将振荡液在50 ℃下超声处理180 min，以4 000 r/min离心15 min，将离心后的样品缓慢过滤至50 mL烧杯中，再使用0.22 μm孔径的有机注射器过滤器将滤液进一步过滤至2 mL棕色小瓶中。最后，将滤液在-40 ℃下保存，以备后续的高效液相色谱（HPLC）分析。
1.4 高效液相色谱分析 采用Agilent 1100系列高效液相色谱仪测定反式白藜芦醇含量，其中色谱柱为Spursil C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）。样品分析采用等度洗脱法，洗脱液由去离子水、甲醇（纯度≥99.9%）和乙腈（纯度≥99.9%）组成，体积比分别为50%、20%和30%。洗脱过程中，流速维持在0.8 mL/min，柱温为30 ℃，每个时间点进样量为20 μL。
反式白藜芦醇的定性和定量分析基于标准物质的保留时间和吸光度，保留时间在6.76～6.78 min，吸光度在306 nm波长下测量。利用HPLC测定0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、50.0 μg/mL 标准样品对应的峰面积积分值，以峰面积积分值为纵坐标、标准样品浓度为横坐标绘制标准曲线，得出一元线性回归方程，并计算样品中反式白藜芦醇含量。
1.5 转录组样品提取 剪取经48 h处理后的花生幼苗根部，用液氮速冻后放入50 mL容量的离心管中用于RNA-seq测试。该试验设4个处理（CK、Cu、ET、Cu_ET），每个处理3个生物学重复，每个生物学重复包含6个花生幼苗。
1.6 RNA提取、cDNA准备和RNA-seq 使用离心柱型植物总RNA提取试剂盒从100～200 mg的冷冻样品中独立提取总RNA。通过1%（W/V）琼脂糖凝胶电泳和260、280 nm的分光光度计检测，确保总RNA的完整性和质量，仅选择260 nm/280 nm吸光度比在1.8～2.0的RNA样品进行后续分析。每个样本中，取10 μg（500 ng/μL）的高质量总RNA用于深度测序和数据集生成。通过使用低聚磁珠从约5 μg总RNA中分离出mRNA，将分离得到的mRNA裂解成短片段（200 nt），并利用随机六聚物引物合成第一链cDNA；使用RNase H和DNA聚合酶I合成第二链cDNA，并通过QIAquick PCR提取试剂盒进行纯化，然后在3′末端添加碱基a尾进行末端修复。测序适配器连接到双链cDNA末端进行PCR扩增。双链cDNA测序通过HiSeqTM 2000设备使用双端技术完成，原始图像通过Illumina GA Pipeline（1.6版本）进行序列处理和碱基质量值计算，最终获得125 bp的对端读取数据。