青钱柳根际微生物及其多糖累积的相关性分析
作者： 陈菲菲 李红英 孙举志 向极钎
摘要 ［目的］了解不同产地青钱柳（Cyclocarya paliurus）根际土壤微生物多样性及其差异，探讨青钱柳多糖与其土壤微生物群落的联系。［方法］以生长野生青钱柳的5个地区（XJC广西小江村，GTC贵州格头村，CBC湖南赤坂村，HGZ江西杨家坪林场，YQP湖北鸦丘坪村）的15个土壤样品为研究对象，提取土壤微生物总 DNA，结合 Illumina MiSeq 高通量测序技术进行研究。［结果］CBC土样的细菌群落多样性最高，GTC土样的细菌群落多样性最低。GTC土样的真菌群落多样性最高，CBC土样的真菌群落多样性最低。经相关性分析可知，细菌Candidatus_Nitrosotalea（奇古菌门的一个未定菌属）与真菌隐球酵母属（Cryptococcus）对青钱柳中多糖类成分累积存在极显著的正相关关系。［结论］野生青钱柳土壤中微生物群落多样性很丰富，存在大量的微生物类群。青钱柳根际土壤群落组成大部分与青钱柳多糖积累之间相关性不大，但青钱柳多糖的积累可能与其氮代谢有关，有望通过调节青钱柳氮代谢促进其多糖积累。真菌隐球酵母属（Cryptococcus）的增殖也有益提高其多糖含量。
关键词 根际微生物；多糖累积；Illumina MiSeq 高通量测序；多样性；相关性
中图分类号 R 284 文献标识码 A
文章编号 0517-6611（2025）04-0149-06
doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2025.04.031
开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
Correlation Analysis of Rhizosphere Microorganisms and Polysaccharide Accumulation in Cyclocarya paliurus
CHEN Fei fei1.2，LI Hong ying1.2，SUN Ju zhi1.2 et al
（1.Enshi Tujia & Miao Autonomous Prefecture Academy of Agricultural Sciences，Enshi，Hubei 445000;2.Hubei Selenium Industry Technology Research Institute，Enshi，Hubei 445000）
Abstract ［Objective］To understand the diversity and differences of rhizosphere soil microorganisms in Cyclocarya paliurus from different origins，and to explore the relationship between Cyclocarya paliurus polysaccharides and its soil microbial community.［Method］ 15 soil samples in soil growing Cyclocarya paliurus from five areas （XJC Xiaojiang Village，Guangxi;GTC Getou Village，Guizhou;CBC Chiban Village，Hunan;HGZ Yangjiaping Forest Farm，Jiangxi;YQP Yaqiuping Village，Hubei） were selected as the research objects.Total DNA of soil microorganisms was extracted and studied using Illumina MiSeq high throughput sequencing technology.［Result］The bacterial community diversity was the highest in CBC soil samples，and the lowest in GTC soil samples.The fungal community diversity was the highest in GTC soil samples，while the lowest in CBC soil samples.According to the correlation analysis，there was an extremely significant positive correlation between the bacterial Candidatus Nitrosotalea （an undetermined genus of thaumarchaeota） and the fungal Cryptococcus on the accumulation of polysaccharide components in Cyclocarya paliurus.［Conclusion］The diversity of microbial communities in the soil of wild Cyclocarya paliurus was very rich.There was little correlation between the composition of soil bacterial communities in the rhizosphere and the accumulation of polysaccharides.However，the polysaccharide accumulation maybe related to its nitrogen metabolism，which was expected to promote the accumulation of polysaccharides by regulating the nitrogen metabolism of Cyclocarya paliurus.The proliferation of Cryptococcus also was beneficial to increase its polysaccharide content.
Key words Rhizosphere microorganisms;Polysaccharide accumulation;Illumina MiSeq high throughput sequencing;Diversity;Correlation
基金项目 国家自然科学基金项目（31560579）；湖北省重点研发计划项目（2022BBA0059）；恩施州科技计划项目（D20230067）。
作者简介 陈菲菲（1988—），女，湖北恩施人，助理研究员，硕士，从事微生物学研究。*通信作者，农艺师，从事微生物学研究。
收稿日期 2024-04-19
青钱柳常生长在海拔500～2 500 m的多云多雾的森林之中，是我国南方特有的药食同源植物，具有降血糖、降血压、提高免疫力等功效［1］。青钱柳在医学界被称为“天然胰岛素”，被美国FDA认可［2］，但其成分复杂，有效成分更是难以分析。
近年来，关于青钱柳的研究越来越多。李磊等［3］研究发现青钱柳叶富含有胰岛素样作用的微量元素，尤其适合糖尿病人饮用。易醒等［4-5］研究发现青钱柳提取物能有效降低实验性糖尿病模型小鼠的餐后血糖，且分析其主要降糖成分为多糖类［6］、甾体类化合物及内酯成分［7］。有学者认为，青钱柳能够降低血糖，可能是因为它含有的功能性成分能够恢复已病变胰岛细胞的结构和功能［8］。
越来越多的研究发现，青钱柳多糖是青钱柳起降糖作用的主要活性成分之一［9-11］。Xie等［10］研究发现青钱柳水提物能有效抑制α-葡萄糖苷酶的活性［10］；王晓敏等［11］研究发现青钱柳水提物能够保护胰腺细胞，从而达到降糖的目的；Ning等［12］从青钱柳提取物中筛选出了11个α-葡萄糖苷酶的潜在抑制剂，发现大部分这些潜在抑制剂与活性位点的结合作用强于阿卡波糖，从而抑制效果也更好。
综上所述，此前针对青钱柳的研究主要围绕其降糖成分和降糖机理方面，对其生长环境的根际微生物群落与其成分积累的相关性少有研究。因此，该研究以生长野生青钱柳（Cyclocarya paliurus）的5个地区（广西桂林龙胜各族自治县平等乡小江村、贵州省黔东南苗族侗族自治州雷山县方祥乡格头村、湖南省怀化市绥宁县黄桑坪苗族乡赤坂村、江西省九江市修水县黄港镇柘坑村杨家坪林场、湖北省恩施市屯堡乡鸦丘坪村）的15个土壤样品为材料，分析野生青钱柳根际微生物群落与其多糖积累的相关性，以期为青钱柳的优质高产栽培提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 研究区域
从自然生长青钱柳的5个地点进行采样，即广西桂林龙胜各族自治县平等乡小江村（XJC）、贵州省黔东南苗族侗族自治州雷山县方祥乡格头村（GTC）、湖南省怀化市绥宁县黄桑坪苗族乡赤坂村（CBC）、江西省九江市修水县黄港镇柘坑村杨家坪林场（HGZ）、湖北省恩施市屯堡乡鸦丘坪村（YQP），采样点基本信息详见表1。
1.2 样品采集
每个采样点采集3～5株生长良好的青钱柳的根际土壤50～100 g，样品保存于灭菌的密封袋中，在-80 ℃下保存，备用。
1.3 仪器与设备
土壤DNA提取试剂盒、DNA胶回收纯化试剂盒，天根生化科技（北京）有限公司；凝胶成像仪，美国伯乐生物科技公司；核酸蛋白浓度测定仪Nanodrop One，赛默飞世尔科技公司；电泳仪，北京六一生物科技有限公司；H-1650R台式高速冷冻离心机，湖南凯达科学仪器有限公司。
1.4 试验方法
1.4.1 土壤总DNA的提取及PCR扩增。采用土壤DNA提取试剂盒提取样品基因组DNA，并用核酸蛋白浓度测定仪Nanodrop One测定其浓度。将每个样品按照下述引物及反应体系配制好，每个样品3个重复，进行PCR扩增。扩增结束后混合每个样品的3个重复的PCR产物，进行凝胶电泳（1%琼脂糖、120 V、30 min）试验。
引物：①扩增土壤微生物16S rRNA 基因V4V5区引物515F（5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′）和907R （5′-CCGTCAATTCMTTTRAGTT-3′）；②扩增ITS1区引物ITS5-1737F（5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′）和ITS4-R （5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）。
50 μL 16S rRNA 基因V4V5区PCR反应体系：引物515F（20 ng/μL）1 μL，引物907R （20 ng/μL）1 μL，2× Premix Taq 25 μL，模板（20 ng/μL）3 μL，灭菌超纯水20 μL。
50 μL ITS1区PCR反应体系：引物ITS5-1737F（20 ng/μL）1 μL，引物ITS4-R（20 ng/μL））1 μL，2× Premix Taq 25 μL，模板（20 ng/μL）3 μL，灭菌超纯水20 μL。