液相色谱-串联质谱法测定焙炒咖啡中丙烯酰胺残留
作者： 毛静春 周琴 李宗师 蒲泓君 金红芳 李莲 王丽芳 王筱楠 程龙
摘要 ［目的］建立液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）测定焙炒咖啡中丙烯酰胺的分析方法。［方法］以13C 3-丙烯酰胺为内标物，样品经超纯水超声浸提，分别经正己烷萃取提取物脂肪、K 4Fe（CN） 6·3H 2O和Zn（CH 3COO） 2沉淀蛋白质、硅藻土和GCB净化等流程获取目标分析物，目标分析物最后经乙酸乙酯萃取浓缩，LC-MS/MS在ESI电离模式下测定丙烯酰胺含量。［结果］丙烯酰胺在10～500 ng/mL具有良好的线性关系（r=0.999 9），在50、100、400 μg/kg加标水平下回收率为71.2%～97.3%，RSD为1.9%～8.4%，方法检出限和定量限分别为13和40 μg/kg。采用该方法对FAPAS质控样进行测定，检测结果均在质控值范围内。［结论］该方法具有良好的线性关系，准确度和精密度均满足定量分析的要求，适用于焙炒咖啡中丙烯酰胺残留的定量分析。
关键词 液相色谱-串联质谱法；焙炒咖啡；丙烯酰胺；残留
中图分类号 TS 207 文献标识码 A
文章编号 0517-6611（2025）04-0174-04
doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2025.04.037
开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
Determination of Acrylamide Residues in Roasted Coffee by Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry
MAO Jing chun，ZHOU Qin，LI Zong shi et al
（Pu’er Institute of Inspection and Testing，Pu’er，Yunnan 665099）
Abstract ［Objective］ To establish an analytical method for the determination of acrylamide in roasted coffee by liquid chromatography tandem mass spectrometry （LC MS/MS）.［Method］Taking 13C 3 acrylamide as the internal standard，the coffee samples were extracted with ultra pure water under ultrasonic，a cleanup by n hexane extraction，K 4Fe（CN） 6·3H 2O and Zn（CH 3COO） 2 precipitation，diatomite and GCB purification were employed to remove fat，protein and some interfering matrix compounds，respectively. The target analyte was finally extracted and concentrated with ethyl acetate，and the acrylamide content was determined by LC MS/MS in ESI ionization mode.［Result］Acrylamide had a good linear relationship between 10-500 ng/mL （r=0.999 9），with recovery rates of 71.2% -97.3% and RSD of 1.9% -8.4% at spiked levels of 50，100 and 400 μg/kg. The detection limit and quantification limit of the method were 13 and 40 μg/kg，respectively.The method was used to determine the quality control samples of FAPAS，and the test results were all within the range of quality control values.［Conclusion］This method has a good linear relationship，and both accuracy and precision meet the requirements of quantitative analysis. It is suitable for the quantitative analysis of acrylamide residues in roasted coffee.
Key words Liquid chromatography tandem mass spectrometry （LC MS/MS）;Roasted coffee;Acrylamide;Residues
基金项目 云南省市场监督管理局科技计划项目（2022YSJK14）。
作者简介 毛静春（1990—），女，云南普洱人，工程师，硕士，从事食品质量与安全研究。
收稿日期 2024-05-23；修回日期 2024-07-24
丙烯酰胺（Acrylamide），白色结晶性粉末，一种重要的高分子材料单体，主要用于医药、环境和涂料等领域［1］。 2002年瑞典科学家首次报道在油炸薯条中检测出丙烯酰胺［2］，随后科研工作者相继在高淀粉、高碳水化合物中检测出一定浓度的丙烯酰胺［3-4］，食品中丙烯酰胺污染问题受到世界各国政府的关注，关于丙烯酰胺的毒理性研究和膳食暴露风险工作纷纷启动。目前丙烯酰胺在动物试验中显示了潜在的致癌性，但尚未发现对人体致癌的证据［5-6］。2018年，美国洛杉矶法院下达了一份判决：加州的咖啡销售者必须在咖啡产品上贴癌症警告标签，明确标示咖啡中含有致癌物质丙烯酰胺，自此丙烯酰胺成为咖啡产品质量安全检测的重要指标之一。因此，建立焙炒咖啡中丙烯酰胺快速准确的测定方法，科学有效监控咖啡质量，对保障消费者的食品安全和咖啡产业的健康发展具有重要意义。
目前对焙炒咖啡中丙烯酰胺残留量的测定主要有分光光度法［7］、气相色谱法（GC）［8］、液相色谱法（LC）［9-10］、气相色谱质谱法（GC-MS）［11-12］和液相色谱串联质谱法（LC-MS/MS）［13-14］等。其中分光光度法通过咖啡中的丙烯酰胺与还原型谷胱甘肽发生加成反应，进而抑制还原型谷胱甘肽将Fe3+还原为Fe2+，测定Fe2+与邻菲啰啉的显色产物，间接计算咖啡中丙烯酰胺的含量，该方法操作简单，但共萃物对化学反应干扰较大，结果准确性和重现性有待提高。色谱质谱联用技术在一定程度上提高了定量和定性的准确性，分析中为提高分析灵敏度多采用衍生试剂与丙烯酰胺发生衍生化反应，采集衍生化产物进而对丙烯酰胺进行定量分析，溴试剂［15-16］、丹磺酸［17］ 和硫代水杨酸［18］为丙烯酰胺测定时常用的衍生试剂，通过衍生化反应有效提高了丙烯酰胺在设备上的灵敏度，有利于低含量丙烯酰胺咖啡样品的分析，但是衍生化反应过程对检验人员的技术能力有较高的要求，衍生化反应的高低和样品与标准曲线衍生条件过程的一致性都会影响检验结果的准确性，因此非衍生化法成为测定咖啡中丙烯酰胺的主流方法。焙炒咖啡作为一种复杂的植物源性产品，较其他食品相比富含脂肪、蛋白质和焙炒过程中产生的色素，净化处理较为烦琐，而丙烯酰胺强极性致使其在处理过程中极易损失，回收率难以保证在国家标准对质量控制要求的回收率范围内，需采用同位素内标校正其处理过程中的回收率以确保测定的准确性。处理过程中丙烯酰胺的损失对设备灵敏度提出了新的要求，因此优化前处理条件、降低基质干扰、提高设备灵敏度、增加分析准确性成为焙炒咖啡中丙烯酰胺测定的两大难点。基于此，该研究拟采用水提取咖啡中的丙烯酰胺，正己烷萃取部分脂溶性杂质、蛋白质沉淀剂沉淀蛋白质、硅藻土-GCB复合净化提取液杂质，通过氯化钠盐析乙酸乙酯萃取净化液中的丙烯酰胺实现丙烯酰胺的富集，建立一种适用、高效的LC-MS/MS测定咖啡中丙烯酰胺的方法，以期为咖啡产品丙烯酰胺的监控提供技术支持。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 试材。咖啡试验样品为2023年阿拉比卡生豆经烘焙后用粉碎机研磨，研磨后待分析用。焙炒咖啡中丙酰胺质控样购自英国FAPAS国际能力验证，证书编号T30135QC，质控值169 μg/kg，允许范围98～240 μg/kg。市售不同厂家的焙炒咖啡豆和焙炒咖啡粉末15份。
1.1.2 试剂。乙酸乙酯、正己烷、甲醇（色谱纯，美国J.T.Baker公司）; 亚铁氰化钾（分析纯，天津风船化学试剂科技有限公司）; 乙酸锌 （分析纯，天津福晨化学试剂有限公司）; 甲酸铵（色谱纯，阿拉丁公司）；氯化钠（分析纯，西陇化工股份有限公司）；甲酸（色谱纯，阿拉丁公司）；石墨化碳黑（GCB）吸附剂（120～400目，天津博纳艾杰尔科技有限公司）；硅藻土（Celite 545，美国Sigma公司）； 丙烯酰胺标准溶液（1ST001221-1000A，1 000 μg/mL，天津阿尔塔科技有限公司）；13C 3-丙烯酰胺 （1ST001221D3-1000M，1 000 μg/mL，天津阿尔塔科技有限公司）。
1.1.3 仪器与设备。API 3500 液相色谱串联质谱仪（美国，AB Sciex公司）;N-EVAP-24氮吹仪（美国Organomation公司）; AS-3120B超声波清洗仪（天津兴特赛恩斯仪器有限公司）; GL-12B 高速冷冻离心机（上海安亭科学仪器厂）;PV-1 旋涡混合器（德国艾卡公司）。
1.2 试验方法
1.2.1 样品制备。
1.2.1.1 样品提取。
准确称取 2 g（精确至 0.01 g）焙炒咖啡粉末样品于 50 mL 具塞塑料离心管中，加入浓度为10 μg/mL丙烯酰胺内标溶液100 μL，再加入2 mL正己烷轻轻摇匀，准确移取20 mL超纯水加入离心管中，于混匀器上混匀1 min 后置于超声清洗仪中超声提取30 min。提取液于离心机上4 000 r/min离心5 min，将上层正己烷层从提取体系中移出，准确移取10 mL下层提取水相至洁净的50 mL离心管中待净化。
1.2.1.2 净化。
上述10 mL待净化液中加入1 mL浓度为1 mol/L 的亚铁氰化钾溶液混匀，再加入1 mL浓度为1 mol/L 的乙酸锌溶液，在混匀器上充分混匀1 min，于离心机上4 000 r/min离心5 min，离心后将上清液转移至洁净50 mL离心管中，沉淀物中加入3 mL水混匀后再次离心，合并2次离心上清液。往离心上清液中加入2 g硅藻土、250 mg GCB于混匀器上混匀1 min，加入10 mL乙酸乙酯和7 g无水氯化钠，手动剧烈振摇1 min，于4 000 r/min离心5 min，移取上清液至玻璃试管中，在50 ℃水浴条件下氮吹至净干，加入1 mL水定容过0.45 μm醋酸纤维素滤膜于自动进样瓶中，待液相色谱串联质谱仪测定。
1.2.2 标准溶液的配制。
1.2.2.1 标准储备液。分别移取1 mL浓度为1 000 μg/mL丙烯酰胺和13C 3-丙烯酰胺溶液至10 mL容量瓶中，用水定容至刻度线，配制浓度为100 μg/mL丙烯酰胺和13C 3-丙烯酰胺单标储备液，于5 ℃下避光保存，有效期30 d。