铜绿假单胞菌外膜蛋白I载体疫苗构建及免疫效果研究

铜绿假单胞菌（Pseudomonasaeruginosa，Pa）可引起人类和畜禽感染，给人体健康及养殖业造成较大危害[1-2]。 通过升高泵出系统活跃度、产生抗菌活性酶等多种机制增强耐药性，导致抗生素治疗效果不明显[3-4]。疫苗可高效、特异防治致病菌感染，且不会造成肠道菌群失调[5]。目前研发的Pa鞭毛疫苗、脂多糖疫苗、灭活疫苗和减毒疫苗等在保护范围和副作用方面有一定缺陷[]。 外膜蛋白I（Outer mem-braneprotein 1，0pr ）可引起多种类型免疫应答，可交叉免疫保护，是良好的疫苗研制靶向蛋白[7]。重组载体疫苗是研究的热点和趋势，常用载体包括痘病毒、沙门菌、卡介苗等[8]目前已研制出OprI蛋白重组沙门氏菌疫苗等。但减毒伤寒沙门氏菌载体，对老年人、儿童和免疫缺陷者应用存在着一定风险[1o]。乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）是食品级微生物，对人和动物无致病性[11]。L.lactis易于构建基因表达载体，具有转化率高，不持续刺激免疫系统，可作为免疫佐剂等优点，目前已成功表达多种蛋白、细胞因子[12-13]。笔者旨在构建表达 外膜蛋白I的重组L.lactis载体疫苗，评价构建的载体疫苗免疫效果，以期为研发可防治Pa感染的疫苗奠定基础。

1材料与方法

1.1试剂、实验动物和菌株溶菌酶，购自美国Ameresco公司；限制性内切酶、高效连接酶、KODPlus购自东洋纺（上海）生物科技有限公司；DNA基因组、质粒提取试剂盒、PCR产物纯化、胶回收试剂盒购自OMEGABio-Tek公司；HRP标记羊抗鼠IgG和IgE购自SouthernBiotech公司； 2× ESTaqMastermix购自北京康为世纪生物科技有限公司；其他试剂市售所得，均为AR级。ICR品系清洁级小白鼠，雌性， 14～16g ，中国医学细菌保藏管理中心铜绿假单胞菌专业实验室自繁自养。L.lactisMG1363菌株，购自宝生物工程（大连）有限公司；大肠杆菌 菌株、pMG36c质粒 抗原，为中国医学细菌保藏管理中心铜绿假单胞菌专业实验室保存。试验于2022年9月—2024年4月在中国医学细菌保藏管理中心铜绿假单胞菌专业实验室进行。

1.2主要仪器T100型梯度PCR仪、550型酶标仪、1652100型电转化仪，美国Bio-Rad公司生产；DYCZ-24FN型电泳仪、WD-9413BX型凝胶成像分析系统，北京市六一仪器厂生产；TGL-16GB型高速台式离心机，上海安亭科学仪器厂生产；VCX1500型超声波破碎仪，美国Sonics公司生产。

1.3 重组质粒构建

1.3.1DHa菌株氯霉素（ Cm） 敏感试验。浓度梯度：液体 LB 培养基为 2.0，4.0，6.0，8.0，10.0up/mL ；固体LB 培养基 为6.0，8.0，10.0，12.0，14.0up/mL将DHa菌株以 2% 接 种量接入LB液体和固体培养基，每组设置3个平行， 恒温静置培养 16h。

1.3.2DH5a感受态细胞制备及pMG36c质粒电转化。DH5a菌株接种 LB 液体培养基， 振荡培养至 OD600=0.5；培养物冰浴20min，7100g，4℃离心 10min ，分别用预冷灭菌 和 10% 甘油洗涤菌体，离心；预冷甘油悬浮菌体， 保存；感受态细胞冰上融化，加入0.5upuLMG36cDNA，混匀；混合物吸入预冷电转化杯底部，电激，程序为2.5kV、200；向电转化杯中加入920uL LB 培养基，移至离心管中， 37℃振荡培养 0.5～1.0h ；涂布含 Cm 的LB固体培养基， 培养转化子。

1.3.3 pMG36c 质粒提取及酶切验证。转化子在含 Cm 的LB液体培养基中活化，镜检，提取质粒；将质粒单酶切和双酶切验证，反应体系见表1。

1.3.4MG1363菌株 Cm 敏感性试验。浓度梯度：GM17液体和固体培养基均为 2.0，4.0，6.0，8.0，10.0g/mL。 2% 接种量接入培养基中，每组设置3个平行， 30% 静置培养 36～48h 。1.3.5MG1363菌株感受态细胞制备及电转方法。参考王洋等[14]的方法，并进行优化，即细胞生长状态（ 、0.5，0.7，0.9，1.2） ，复壮时间 （1、3、5、7、9h） ，质粒添加量（ 60，80，100，120，140ng） 和转化电压（1.0、1.5、2.0、2.5、3.0kV ）为单因素。计算电转化效率：

电转化效率（CFU＼DNA}）=菌落总数 （CFU DNA1.3.6重组质粒 pMG36c-OprI 构建。试剂盒提取 Pa27853 菌株基因组DNA；根据GenBank中 的OprI基因序列和pMG36c载体特点设计引物（表2），其中P32-F根据pMG36c载体上的P32启动子序列进行设计。

以 Pa DNA为模板，PCR扩增 基因，反应体系见表3。扩增条件 共30个循环，最后 延伸 5min 。取5～LPCR产物用于 琼脂糖凝胶电泳。

重组质粒构建：无缝连接试剂盒连接，总体系20uL，其中高效连接酶10.0uLpMG36c 质粒 3.5upL，I基因片段6.5uL摇匀， 水浴 30min 。

1.4重组质粒转化MG1363菌株

1.4.1重组质粒。 5uL与80uL感受态细胞混匀，加入mathrm预冷电转化杯，电激，程序为 2.5kV，200，25u， 。向电转化杯中加入920uL LB 培养基，移至离心管中 静置培养 0.5～1.0h 。浓缩菌液，涂布含 Cm 的LB固体培养基， 培养，筛选转化子。

1.4.2转化子验证。菌落PCR反应体系： 2×Es Taq Master-mix菌液 8uL，OPRI-F和OPRI-R（ 10pmoluL}）均1uL扩增条件 90s ，共30个循环，最后 延伸 5min 。

1.4.3转化子重组质粒提取与酶切验证。方法同"1.3.3”。

1.4.4转化子重组质粒测序验证。以P32-F为测序引物，对提取得到的重组质粒进行测序验证。测序结果由北京睿博兴科生物技术有限公司提供，利用Snapgene软件进行序列对比。

1.5重组菌株OprI蛋白表达检测重组菌株和MG1363菌株菌体超声破碎后SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测，分离胶 15% 、浓缩胶 5% ；染色，凝胶脱色。

1.6重组载体疫苗安全性、异常毒性试验

1.6.1疫苗制备。重组菌株按 1% V/V比例接种含 cm 的GM17液体培养基， 30% 培养 至1.0，离心收集菌体，PBS溶液洗涤2次，制成浓度 （20 CFU/mL 菌悬液， 保存。