玫烟色虫草发酵液对尖孢镰刀菌的抑制作用研究

尖孢镰刀菌（Fusariumoxysporum）是瘤座孢科镰刀菌属，被列为世界十大植物病原真菌之—[1-2]。该菌通过兼性寄生对黄瓜、西瓜、番茄、香蕉、苜蓿等超过100种经济作物造成侵染，引发枯萎病和根腐病等，严重影响植物的生长发育和生产效益[3-5]。随着作物重茬耕作及种植面积扩大，尖孢镰刀菌能在土壤和植株根部定殖，堵塞导管，阻止水分运输并导致地下根部腐烂甚至植株大面积枯萎死亡[6-8]。目前，针对枯萎病防治以培育抗性品种、砧木嫁接和喷施化学药剂为主，但带来了育苗成本高、农田环境污染等问题[9]。因此，探寻高效生态、绿色安全的生物产品成为行业热点。

近年来，利用有益生防菌及其代谢产物进而研发制剂用于防治植物病害的研究已取得显著进展[10]。韦巧婕等[11]从黄瓜根际土壤中分离得到一株芽孢杆菌并发现与有机肥料混合施用对黄瓜枯萎病的平均防效高达 80.7% 。夏龙荪等[12]研究表明，球孢白僵菌Bb1发酵液振荡培养14d处理油菜菌核病菌、棉花枯萎病菌和小麦赤霉病菌5d的抑制率分别达 49.17%.55.48% 和 48.31% 。木霉也是研究较为广泛的生防真菌之一，对镰刀菌、霉菌、立枯丝核菌等病原菌均有抗生作用[13]。张春秋等[14]研究发现，3种不同木霉菌对黄瓜枯萎病菌的抑制率都在 74% 以上。

玫烟色虫草（Cordycepsfumosorosea），也称玫烟色棒束孢，广泛分布在热带和亚热带地区，是重要的昆虫病原真菌资源，具有适应性强、寄主昆虫范围广、致病力强等特点。玫烟色虫草属于子囊菌亚门（Ascomycota）、核菌纲（Pyrenomy-cetes）、肉座菌目（Hypocreales）、虫草菌科（Cordycipitaceae）虫草菌属（Cordyceps）[15]。玫烟色虫草用于生物防治控制烟粉虱、小菜蛾、梨小食心虫、桃粉蚜等害虫致死率高，在生物防治领域仍有较高的实践应用潜力。而与其同属的白僵菌不仅能防控应对害虫，对多种植物病原菌均有明显的抑制效果[16]。研究表明，玫烟色虫草处理黄瓜幼苗后可有效提高植株生理指标、保护酶系统及活性氧代谢体系，相比于化学农药更安全，对丙二醛含量和植物膜系统的影响较小[17-18]

笔者以玫烟色虫草IF-1106菌株发酵液为试验材料，研究玫烟色虫草对尖孢镰刀菌菌丝生长、孢子萌发的影响，并测定其对尖孢镰刀菌细胞膜透性及菌体蛋白含量的抑制效果，并对其抑制机理进行探索，以期为玫烟色虫草的制剂研发提供理论参考。

1材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1病原菌。尖孢镰刀菌（Fusariumoxysporum），由吕梁学院微生物资源开发利用实验室提供。

1.1.2生防菌。玫烟色虫草（Cordyceps fumosorosea）IF-1106菌株，由吕梁学院微生物资源开发利用实验室提供。

1.1.3培养基。PDA培养基：马铃薯 200g ，葡萄糖20g，琼脂18g，蒸馏水 。

PD培养基：马铃薯 200g ，葡萄糖 ，蒸馏水 1000mL。

1.2 试验方法

1.2.1玫烟色虫草发酵滤液的制备。取出 下活化培养7d的玫烟色虫草IF-1106菌落，加水制成含孢子悬浮液并调整浓度至 CFU/mL，再将孢子悬浮液浓度分别调节为 将上述5种浓度梯度的孢子悬浮液各取 10mL 加到 200mL PD培养基中， 恒温振荡培养 7d 。培养结束后过滤离心，在 下离心 15min 后取上清液，得到玫烟色虫草发酵液并保存待用。

1.2.2玫烟色虫草IF-1106菌株发酵液对尖孢镰刀菌菌丝生长的影响。采用菌丝生长速率法[19-20]，测定玫烟色虫草IF-1106对尖孢镰刀菌的抑菌活性，将灭菌后冷却至 的PDA培养基分别添加 1mL 不同浓度的玫烟色虫草发酵液混匀，制成PDA平板。以加入等体积的无菌水作空白对照，每个浓度重复3次。将培养7d的尖孢镰刀菌用 10mm 打孔器打菌饼，倒置转接至药板中央，然后放在 的生化培养箱中培养。从第3天开始，每隔 24h 用十字交叉法测定菌丝生长直径并计算抑菌率，至对照组菌丝覆盖培养皿。

菌丝生长抑菌率 （对照菌落直径-处理菌落直径）/对照菌落直径 ×100%

1.2.3玫烟色虫草IF-1106发酵液对尖孢镰刀菌孢子萌发的影响。采用凹片法[21]，测定其对尖孢镰刀菌孢子萌发的抑制作用，制备浓度为 尖孢镰刀菌孢子悬浮液，分别取  10CFU/mL的玫烟色虫草发酵液与尖孢镰刀菌孢子悬浮液各100uL1：1滴至凹玻片上混匀，以无菌水作对照，每个浓度重复3片， 下保湿培养。 12h 后在显微镜下观察孢子萌发情况，以芽管长度超过孢子直径 50% 为萌发标准[22]每个处理检测3个视野，每个视野检测200个孢子，计算孢子萌发率及抑制率。

孢子萌发率 σ=σ 萌发孢子数/检查孢子总数 ？×100% 孢子萌发抑制率 （对照孢子萌发率-处理孢子萌发率）/对照孢子萌发率 .×100%

1.2.4玫烟色虫草IF-1106发酵液对尖孢镰刀菌细胞膜通透性的影响。采用电导法[23]，将尖孢镰刀菌孢子悬浮液用移液枪移取 2mL ，加到PD培养基后 摇床培养3d，分别加人不同浓度的玫烟色虫草发酵液 5mL 至上述摇床后的尖孢镰刀菌发酵液中。每个处理重复3次，以无菌水作空白对照。在 0，15，30，60，90，120，180min 时用电导仪测定电导率，通过电导率判断细胞膜通透性。

1.2.5玫烟色虫草IF-1106发酵液对尖孢镰刀菌菌体蛋白含量的影响。采用考马斯亮蓝G-250 比色法[24]，在摇床培养后的尖孢镰刀菌发酵液中分别加入不同浓度的玫烟色虫草发酵液 5mL ，取 10mL 样品离心，离心后吸取 0.5mL 上清液，加到 10mL 的具塞试管中，再加入考马斯亮蓝G-250溶液 5mL ，充分混匀后放置 3min ，然后在 595nm 处测定吸光度，添加不同浓度的发酵液为处理，添加无菌水设为对照，每个处理设置3次重复，然后通过蛋白质标准曲线计算蛋白质含量。

1.3数据统计与分析利用MicrosoftExcel2010整理试验数据，采用SPSS27.0统计分析软件对数据进行方差分析并进行差异显著性检验（ P<0.05）。

2 结果与分析

2.1玫烟色虫草IF-1106发酵液对尖孢镰刀菌菌丝生长的影响不同浓度玫烟色虫草发酵液对尖孢镰刀菌菌落直径的影响见表1。由表1可知，随着玫烟色虫草发酵液孢子浓度的降低，尖孢镰刀菌菌落直径也逐渐增大。玫烟色虫草浓度在 时抑制效果最好，7d后其菌落直径只有 5.48cm 。而空白对照尖孢镰刀菌菌落直径达 7.93cm 。

由表2可知，随着玫烟色虫草发酵液浓度的降低，其对尖孢镰刀菌菌落的抑菌率也逐渐减小。当玫烟色虫草发酵液浓度为 时，对尖孢镰刀菌的抑制率在6d时达到最高 30.90% ，此后不再升高。 CFU/mL玫烟色虫草发酵液浓度对尖孢镰刀菌的抑制率最低，7d后只有8.44% 。

2.2玫烟色虫草IF-1106发酵液对尖孢镰刀菌孢子萌发的影响不同浓度的玫烟色虫草发酵液对尖孢镰刀菌孢子萌发的影响见表3。从表3可以看出，玫烟色虫草发酵液对尖孢镰刀菌的孢子萌发同样具有抑制作用，且发酵液的浓度越大，对孢子萌发的抑制作用越强。其中当浓度为 1. 0×10CFU/mL时，抑制效果最好，抑制率达 46.48% 。