周氏啮小蜂CcGSTS1基因的克隆·蛋白表达纯化及酶学特征分析

摘要 鉴定一个编码周氏啮小蜂谷胱甘肽S-转移酶序列的全长基因CcGSTS1，系统发育分析发现，该基因与丽蝇蛹集金小蜂NvGSTS6基因具有高同源性。体外表达、纯化的重组CcGSTS1可催化CDNB与GSH结合，最适反应pH为7.0。该试验为进一步研究周氏啮小蜂CcGSTS1基因功能奠定基础。

关键词 周氏啮小蜂；谷胱甘肽S-转移酶；系统发育分析；酶活

中图分类号 Q965.9 文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2024）02-0093-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.02.019

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Cloning，Expression，Purification and Enzyme Activity of CcGSTS1 from Chouioia cunea Yang

QIN Dong-yu，REN Rui，SUN Mei-di et al

（Tianjin Normal University/Tianjin Key Laboratory of Animal and Plant Utilization and Protection，Tianjin 300387）

Abstract In this study，we characterized a full-length gene encoding GST sequences CcGSTS1 from C.cunea.Phylogenetic analysis showed that CcGSTS1 shared the highest identity with NvGSTS6 of Nasonia vitripennis.The recombinant CcGSTS1 showed glutathione-conjugating activity toward CDNB （1-chloro-2，4-dinitrobenzene） and GSH （Glutathione）.The optimal reaction pH value is 7.0.This study provides a foundation for further study on the function of CcGSTS1 gene in C.cunea.

Key words Chouioia cunea Yang;Glutathione S-transferases;Phylogenetic analysis;Enzyme activity

基金项目 天津市教委科研计划项目（2019KJ089）。

作者简介 覃东玉（1997—），女，广西来宾人，硕士研究生，研究方向：昆虫学。*通信作者，副教授，博士，从事昆虫学研究。

收稿日期 2023-02-06

昆虫的宿主适应性及杀虫剂抗性与解毒代谢相关蛋白密切相关，主要包括ABC转运蛋白（ATP-binding cassette transporters，ABC）、细胞色素p450（cytochrome P450s，P450s）、羧酸酯酶（carboxylesterases，CarEs）和谷胱甘肽S-转移酶（glutathione s-transferases，GSTs）^[1]。谷胱甘肽S-转移酶催化谷胱甘肽（glutathione，GSH）与底物结合，增加代谢产物的水溶性，促进其排出体外^[2]。根据谷胱甘肽S-转移酶在细胞内的位置，GSTs可分为3类：胞质GSTs、微粒体GSTs和线粒体GSTs。迄今为止，在昆虫中只发现了胞质GSTs与微粒体GSTs^[3-4]，胞质GSTs通常被分为至少6类：Delta、Epsilon、Omega、Sigma、Theta和Zeta^[5]。普遍存在于原核生物和真核生物中谷胱甘肽S-转移酶，除对内源性和外源性化合物的解毒作用以外，还参与多种细胞生理生化反应，如胞内物质运输、激素的生物合成和抗氧化应激等^[6]。此外，谷胱甘肽S-转移酶可作为气味降解酶，在昆虫嗅觉感受系统中降解气味分子^[7-9]，如玉米象（Sitophilus zeamais）的SzeaGSTd1可能通过降解宿主挥发物中的辛醇，从而辅助定位宿主^[10]，烟草天蛾（Manduca sexta）触角的性信息素敏感感受器中具有触角特异性表达GST，可能通过灭活醛类气味分子来保护嗅觉系统^[11]。

蛹寄生蜂周氏啮小蜂（Chouioia cunea Yang）是杨忠岐等^[12-13]在我国筛选出的一种对美国白蛾具有高寄生率的天敌昆虫，在美国白蛾的生物防治中起着关键作用。有关周氏啮小蜂的室内繁育，蜂种复壮，不同温湿度对小蜂寄生率、发育历期、成蜂寿命的影响等方面均已有详尽研究^[14-16]，但有关其对杀虫剂的解毒代谢分子机制尚缺乏研究。Li等^[17]在周氏啮小蜂嗅觉分子机制研究中发现，美国白蛾蛹挥发物1-十二烯对小蜂已交配雌性具有较强的引诱性，但其诱发周氏啮小蜂嗅觉反应的分子机制尤其是降解机制尚不明确。笔者从周氏啮小蜂的转录组数据中筛选谷胱甘肽S-转移酶基因，分析该基因的序列保守性及系统进化关系，并克隆CcGSTS1基因，体外诱导、表达并纯化CcGSTS1蛋白，分析该蛋白的活性，旨在为进一步分析CcGSTS1在周氏啮小蜂解毒代谢中的作用或气味降解中的作用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

供试昆虫：周氏啮小蜂，由河南省漯河市豫中南林业有害生物天敌繁育研究中心惠赠，在实验室接种于柞蚕蛹（Antheraea pernyi）上进行传代培养。培养条件：温度（25±0.5）℃，相对湿度（70±10）%，光周期14 L∶10 D。

主要试剂和工具酶：总RNA 提取试剂（RNA isolater Total RNA Extraction Reagent）、反转录试剂盒（HiScriptII 1st Strand cDNA Synthesis Kit）、DNA凝胶回收试剂盒（FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit）、质粒提取试剂盒（FastPure Plasmid Mini Kit）购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；限制性内切酶、PCR 所需 ExTaq primix 酶购自宝生物工程（大连）有限公司；引物合成及测序由苏州金唯智生物科技有限公司完成；其他如氯仿、异丙醇等试剂均为国产或进口分析纯试剂。

菌种及质粒：大肠杆菌Transetta （DE3） Chemically Competent Cell、Trans1-T1 Phage Resistant Chemically Competent cell 购自北京全式金生物有限公司；原核表达载体pGEXKG1为实验室保存。

1.2 方法

1.2.1 序列分析及系统发育树构建。

周氏啮小蜂谷胱甘肽S-转移酶1（CcGSTS1）碱基序列由笔者所在课题组早期全长转录组测序获得^[18]。氨基酸序列由BioEdit软件（Isis Pharmaceuticals，Carlsbad，CA）生成。应用在线服务器（http：//www.detaibio.com/sms2/protein_iep.html）计算成熟蛋白质的分子量及等电点。采用Signalp-5.0服务器（https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php？SignalP-5.0）对信号肽进行预测。通过SMART服务器（http：//smart.embl-heidelberg.de/）对CcGSTS1的保守结构域进行分析。应用MEGA 7.0软件align by clustalW程序，选择默认参数进行序列对齐，采用p-distance模型对间隙进行删除，phylogency程序构建系统发育树。

1.2.2 总RNA提取与cDNA合成。

取周氏啮小蜂成虫称重100 mg，用液氮研磨后，按照 RNA isolater Total RNA Extraction Reagent说明书提取总 RNA，经1% 琼脂糖凝胶电泳检测后，根据反转录试剂盒说明书进行反转录反应获得单链 cDNA。

1.2.3 重组表达质粒构建。

根据CcGSTS1的基因序列，利用 Primer 5.0设计特异性引物（sense：CGCGGATCCATGCCTATGGAGCAGATGC，antisense： CCGCTCGAGAAATTGGGTTTTGGGTCGT）。以周氏啮小蜂单链 cDNA 为模板，进行 PCR 扩增，将回收的DNA片段连接在克隆载体pMD 19-T，阳性克隆送测序验证。用BamH Ⅰ/Xho Ⅰ 双酶切并连接表达载体pGEX-KG，将连接产物转化至大肠杆菌E.coli 菌株（Trans1-T1）感受态细胞。挑取单菌落，扩大培养后利用质粒提取试剂盒进行质粒提取。对抽提出的质粒进行双酶切鉴定和测序验证。

1.2.4 重组蛋白原核表达与纯化。

应用重组质粒pGEX-KG-GSTS1转化E.coli Rosetta（DE3） 表达菌株感受态细胞，挑取单菌落进行扩大培养，37 ℃振荡培养至菌液OD_{600 nm}为0.8～1.0，加入IPTG 至终浓度为0.4 mmol/L 进行诱导表达，继续振荡培养4 h。收集诱导表达菌体，用PBS缓冲液重悬菌体，超声波破碎后于4 ℃下10 000 r/min 离心15 min。收集上清，与谷胱甘肽树脂，于4 ℃层析柜结合，随后将结合液于4 ℃下 1 200 rcf离心5 min，弃掉上清液，用PBS缓冲液进行洗涤3次，然后加入Thronbim酶，于4 ℃酶切除GST标签，最后加入PBS缓冲液洗脱，收集上清即为纯化的蛋白，在4 ℃ 用透析袋透析去盐（透析液 20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.4） 2次，每次4 h。纯化后采用 BCA 法对蛋白质进行定量。然后将10 μL纯化蛋白用 SDS-PAGE 检测，最后存至冰上放至4 ℃冰箱保存，用于酶活性检测分析。

1.2.5 谷胱甘肽S-转移酶活力测定。

CcGSTS1活性测定：反应体系包括100 mmol/L 磷酸盐缓冲液（pH 7.5） ，1 μg CcGSTS1蛋白，GSH 终浓度为 1 mmol/L，CDNB 终浓度为2 mmol/L，在25 ℃条件下检测 340 nm 处的吸光值，以PBS 缓冲液作为对照。每处理重复3次，每1 min 测定1次，共测定 9 min。将所得数值经过整理带入公式求出酶活力。CcGSTS1活力计算公式如下：

比活力[μmol/（min·mg）]=（ △OD₃₄₀×V）（ ε×T×L×E）

式中：△OD₃₄₀为单位时间内吸光度的变化值，V为酶促反应体积（200 μL） ，ε 为产物的消光系数（ 9.6 mmol/cm），T 为反应时间（1 min） ，L 表示光程 （1 cm），E为加入酶量（1 μg）。

pH对CcGSTS1催化活性的影响：反应体系包括终浓度分别为2 mmol/L CDNB 和1 mmol/L GSH，1 μg目的蛋白，100 mmol/L 磷酸盐缓冲液，同时将反应体系中的100 mmol/L 磷酸盐缓冲液（ pH 7.5） 替换成不同pH 梯度缓冲盐溶液（pH 4.0、5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的100 mmol/L 磷酸盐缓冲液，pH 8.5、9.0、10.0、11.0、12.0的100 mmol /L Tris-HCl 缓冲液），反应在25 ℃下进行。每处理进行3次重复。检测在340 nm 处的吸光值，分别于1 min 和6 min各测定1次，按照上述方法测定酶活力。