不同发育时期澳洲坚果叶片花青素分析

摘要 [目的]探究不同发育时期澳洲坚果叶片花青素的含量变化。[方法]以云南省临沧市澳洲坚果种植基地广泛种植的优良品种O.C.为研究材料，利用超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）检测不同发育时期（开花后30、60、90d，分别标记为S₁、S₂、S₃）澳洲坚果叶片花青素含量。[结果]澳洲坚果叶片中共检测出108种代谢产物，S₁较S₂共有7种显著差异代谢物质，S₁较S₃共有18种显著差异代谢物质，S₂较S₃共有20种显著差异代谢物质。以S₁为对照，S₂有1个物质含量上调，5个物质含量下调；而S₃有5个物质含量上调，13个物质含量下调。以S₂为对照，S₃有6个物质含量上调，14个物质含量下调。S₁、S₂、S₃样品比较，共有6种显著差异代谢物，分别是芍药花色素-3-O-半乳糖苷、芍药花色素-3-O-阿拉伯糖苷、锦葵色素-3-O-半乳糖苷、锦葵色素-3-O-阿拉伯糖苷、锦葵色素-3-O-葡萄糖苷和柚皮素，且这6种共有显著差异代谢物主要在S₁时期合成，且含量随着叶片的生长而下降。[结论]该研究结果为坚果叶片的高值化利用提供了新思路。

关键词 澳洲坚果叶片；不同发育时期；花青素含量

中图分类号 TS255.7

文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2024）02-0181-06

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.02.040

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Analysis of Anthocyanins in Macadamia Leaves at Different Developmental Stages

SHI Peng-fei，SHI Rui，CAI Ting-ting et al

（1.Key Laboratory for Forest Resources Conservation and Utilization in the Southwest Mountains of China，Ministry of Education/International Ecological Foresty Research Center of Kunming/Forestry College of Southwest Forestry University，Kunming，Yunnan650224;2.Yunnan Forestry Technological College，Kunming，Yunnan650224）

Abstract [Objective]To explore the changes of anthocyanin content in macadamia leaves at different developmental stages.[Method]Using the excellent variety O.C.widely planted in the Macadamia nut planting base in Lincang City of Yunnan Province as the research material，the anthocyanin content of macadamia leaves at different developmental stages （30，60，and90days after flowering，labeled as S₁，S₂and S₃） was detected using ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （UPLC-MS/MS）.[Result]A total of108metabolites were detected in macadamia leaves.There were7significantly different metabolites in S₁compared with S₂，18significantly different metabolites in S₁compared with S₃，and20significantly different metabolites in S₂compared with S₃.Taking S₁as the control，the content of1substance was up-regulated and the content of5substances was down-regulated in S₂，and5substances were up-regulated and13substances were down-regulated in S₃.Compared with S₂，S₃had6substances up-regulated and14substances down-regulated.Compared with the three samples S₁，S₂and S₃，there were6significantly different metabolites，which were paeoniflorin3-O-galactoside，paeoniflorin3-O-arabinoside，malva pigment-3-O-galactoside，malva pigment-3-O-arabinoside，malva pigment-3-O-glucoside and naringenin.The metabolites were mainly synthesized in S₁period，and their contents decreased with the growth of leaves.[Conclusion]The results of this study provide new ideas for high value utilization of nut leaves.

Key words Macadamia leaves;Different developmental stages;Anthocyanin content

基金项目 国家自然科学基金项目（32260720）；国家重点研发计划项目 （2021YFD1000202）；国家现代农业产业技术体系（CARS-21-05B）；云南省重大科技专项（202102AE090042，202002AA10007，2019ZG00901）；云南省千人计划高端外国专家专项（2019013）；云南省级财政林业科技推广示范专项（〔2020〕ts09号）；外专引智项目（G2021039002，202105AQ130011）；昆明市科技揭榜制项目（2021JH002）。

作者简介 史鹏飞（1987—），男，河北沧州人，经济师，硕士，从事林业项目管理及造林技术研究。*通信作者，高级工程师，博士，从事林业工程技术及农林病虫害防治研究。

收稿日期 2022-12-01；修回日期 2023-02-14

澳洲坚果（Macadamia integrifolia F.Mull），又称夏威夷果，原产于澳大利亚，属山龙眼科（Proteaceae）澳洲坚果属（Macadamia）常绿乔木果树^[1-2]。1979年开始进行环境适应性试验发展至今，我国已成为世界上澳洲坚果种植面积最大的国家^[3]。经过近40年的研究与发展，我国澳洲坚果种植面积已超越澳大利亚和南非，广东、广西、云南、福建、四川、重庆、贵州等地已均有种植^[4]。我国已成为澳洲坚果种植面积最大的国家，对此相关研究也日益增多。当前，国内外对澳洲坚果的研究主要集中于种植技术、病虫害防治、果仁油脂加工及副产物的综合利用等^[5-9]，但对叶片的相关报道相对比较少。Stephenson等^[10]研究了澳洲坚果产量与叶片营养状况、气候、品种、土壤等的关系，而Herbert等^[11]对昆士兰东南部澳洲坚果叶片中氮、钾、磷、钙、硼等的营养水平季节性模式进行研究。已有研究表明，植物叶片中含有丰富的花青素等活性成分，如芒果、番石榴等^[12-13]。

花青素广泛存在于开花植物（被子植物）中，是一种酚类化合物，据统计，花青素广泛存在于27个科73个属植物中。酚类化合物是植物界中最重要的族群之一，是植物中含量最高的次生代谢产物，通常以酯或糖苷形式存在。花青素的基本结构为3，5，7-羟基-2-苯基苯并芘喃，大多数花青素在花色基元的3-、5-、7-碳位上有取代羟基。由于其结构中R1和R2碳位上的取代基不同，形成了各种各样的花青素，目前已知的有20种花青素，在植物中常见的有6种，分别为天竺葵素、矢车菊素、飞燕草素、芍药花色素、矮牵牛素和锦葵色素^[14-16]。研究表明，花青素与植物抗逆性相关，能提高植物抗低温、干旱和强光等逆境的能力，降低植物紫外辐射和病害的程度，保护植物，减轻损伤^[17]。同时，因其具有清除自由基、提高抗氧化性、保护血管、降低血脂、抗肿瘤等一系列生理功能，被广泛应用于药品、保健品、化妆品以及动物生产等领域^[18-19]。澳洲坚果在种植的过程中修枝整形是树形管理的重要手段，修剪下来的大部分树叶都没有被充分利用，近年来有澳洲坚果叶茶的研究，澳洲坚果叶茶中酚类物质占总挥发性成分的36.86%，说明澳洲坚果叶中的花青素对澳洲坚果叶茶中的香气具有重要的贡献，且部分花青素具有抗氧化作用^[20]。相关研究利用气相色谱-质谱联用仪鉴定澳洲坚果幼叶挥发性成分^[21]，由此鉴定出对羟基苯甲醛、3，5-二叔丁级-4-羟基苯甲醛2种酚类挥发性成分。因此，该研究采用代谢组学方法，探究不同发育时期澳洲坚果叶片花青素的含量和代谢途径，为坚果叶片花青素在澳洲坚果叶茶、药品、化妆品等方面的开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试材料。从云南省临沧市大雪山乡澳洲坚果种植基地（24°02′N，99°44′E）选取长势良好、叶片无病虫害的O.C.品种澳洲坚果树，根据澳洲坚果叶片不同发育时期花青素含量的变化，分别采集花后30、60、90d的健康叶片（分别标记为S₁、S₂和S₃），每个时期设置3组生物学重复，用0℃冰盒带回实验室，洗净，液氮速冻后保存于-80℃超低温冰箱中备用。

1.1.2 试剂。色谱级甲酸（Sigma-Aldrich）；优级纯盐酸（信阳市化学试剂厂）；色谱级甲醇（Merck）。

1.1.3 试验仪器。MM400球磨仪（Retsch）；AS60/220.R2电子天平（RADWAG）；KQ5200E超声清洗仪（上海净信）；5424R离心机（Eppendorf）；MIX-200多管涡旋振荡器（上海净信）；QTRAP6500+LC-MS/MS（SCIEX）。

1.2 试验方法

1.2.1 样品处理。冷冻真空干燥试验样品，用30Hz球磨仪研磨1.5min至粉末状，称取50mg粉末状样品，将之溶解在500μL提取液（50%甲醇水溶液，含0.1%盐酸）中；用多管涡旋振荡器涡旋5min，超声清洗仪超声5min，离心机离心3min（12000r/min，4℃），吸取上清液，再重复1次上述步骤；合并2次上清液，用0.22μm微孔滤膜过滤样品，后保存于进样瓶中进行UPLC-MS/MS分析。

1.2.2 UPLC-MS/MS条件。