马铃薯高效再生及遗传转化体系的优化

摘要 为优化马铃薯高效再生及遗传转化体系，研究鄂马铃薯3号茎段外植体在不同激素浓度配比下愈伤组织及分化情况，获得最佳愈伤组织及分化激素配比，再采用根癌农杆菌的遗传转化进行筛选，获得最佳转化体系，为马铃薯优质品种的基因工程育种提供依据。结果表明，不同激素浓度配比下愈伤组织及分化率差异较大，其中2.0 mg/L ZR+0.1 mg/L IAA 激素配比下可高效再生出芽，出芽率高达100%，芽长势粗壮。通过构建植物表达载体pCambia1301，以GV3101为介导菌株，预培养2～3 d，共培养2～3 d，350 mg/L羧苄青霉素，50 mg/L卡那霉素筛选浓度转化效果较好，转化效率可达65%，其中转化苗在0.8 mg/L IBA+0.2 mg/L NAA激素配比的培养基中可形成再生植株，再生率达80%，苗茎粗壮，根系发达。

关键词 马铃薯；茎段；激素；遗传转化；转化率

中图分类号 S532  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2024）03-0035-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.03.009

Optimization of High Efficiency Regeneration and Genetic Transformation System in Potato

Abstract In order to optimize the efficient regeneration and genetic transformation system of potato， the effects by using stem segment of Hubei potato No.3 as explants were studied in different hormone concentration ratios， and the optimal callus and differentiation hormone ratio were obtained. Then， the genetic transformation of Agrobacterium tumefaciens was used for screening to obtain the best transformation system， which provided the basis for genetic engineering breeding of high quality potato varieties. The results showed that the callus and differentiation rate were great different under the ratio of different hormone concentration. The hormone ratio of 2.0 mg/L ZR and 0.1 mg/L IAA could regenerate the buds efficiently， the germination rate was as high as 100%， and the bud growth was strong. By constructing expression vector pCambia1301 in plant， GV3101-mediated strain， pre-cultured for 2-3 days， and co-cultured for 2-3 days， and 350 mg/L carbenicillin， and 50 mg/L kanamycin to screen the concentration was better. The transformation efficiency could reach 65%. The transformed seedlings could form regenerated plants in the medium of 0.8 mg/L IBA and 0.2 mg/L NAA hormone. The regeneration rate could reach 80%， the stems were thick and the roots were developed.

Key words Potato;Stem segment;Hormone;Genetic transformation;Conversion rate

马铃薯（Solanun tuberosum L.）为茄科茄属一年生草本块茎植物［1］，是我国主要粮食作物之一，产量排在小麦、玉米、水稻之后占第四位［2］。马铃薯具有生长周期短、营养丰富、加工产品众多等特点，在农业生产及人民生活中占有重要地位。

马铃薯栽种常采用无性繁殖的方式［3］，即块茎的种苗繁育方式。这导致许多品种发生退化，且随着栽培年限的延长更加严重。研究发现其原因在于各种病毒、细菌、真菌等对马铃薯块茎和种苗的侵染。采用植株组织培养的方式可连续产生优质种苗和无毒种薯。通过马铃薯茎尖的脱毒、叶片和茎段等器官的快繁都能达到较好的效果［4-6］。另外，通过基因工程技术培育抗病、抗虫及抗逆性强、品质改良的种薯［7-8］。

许多国内外研究者［9-12］对马铃薯再生体系进行了研究，MS为常用的基本培养基；茎尖、茎段、薯块等是再生途径中主要采用的外植体；实验常采用的激素有细胞分裂素6-BA和ZT，细胞生长素IAA、NAA、2，4-D、赤霉素。虽然马铃薯遗传转化体系已有报道，但由于适用的转化受体及外植体材料存在差异［13-15］，转化过程也有从愈伤的间接再生体系和直接分化再生体系的存在［16-18］，导致马铃薯试验所需试验条件及培养基组成等差异明显。笔者研究了不同激素配比对马铃薯品种鄂马铃薯3号茎段愈伤组织诱导及分化的影响，在此基础上优化了根癌农杆菌的遗传转化体系，为马铃薯优质品种的选育奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

采用鄂马铃薯3号无菌瓶苗茎段作为外植体。

1.2 培养基

以MS培养基，附加不同6-BA、ZR、NAA、IAA、GA3激素，20 g/L蔗糖，8 g/L琼脂，pH 5.8，作为愈伤诱导及分化的基本培养基。以MS+30 g/L蔗糖+pH 5.8作为根癌农杆菌转化时侵染液。以MS+30 g/L蔗糖+8 g/L琼脂+pH 5.8，附加不同浓度IBA和NAA，作为转基因植株再生的基本培养基。以LB作为菌体培养的基本培养基，即5 g/L酵母提取物，10 g/L蛋白胨，10 g/L氯化钠，17 g/L琼脂，pH 7.0，附加50 mg/L利福平（Rifampin，以下简写为Rif）和50 mg/L卡那霉素（Kanamycin，以下简写为Kan）。

1.3 愈伤组织诱导及芽的分化

将苗龄15～20 d的马铃薯无菌瓶苗茎段切成长0.5～0.8 cm小段，接种于附加不同浓度6-BA、ZR、NAA、IAA、GA3的13种梯度培养基（表1）中，进行愈伤组织的诱导及分化，每个梯度3个重复。20～25 ℃光照培养，1 500～2 000 lx光照16 h，培养20 d后观察愈伤出愈情况及出芽率（出芽率=出芽的外植体数/外植体总数×100%）。

1.4 遗传转化体系的构建

1.4.1 农杆菌菌液制备。

构建植物表达载体pCambia1301，利用GV3101菌株，获得农杆菌菌液。农杆菌单菌落在附加50 mg/L Rif和50 mg/L Kan的LB液体培养基中28 ℃、200 r/min振荡过夜培养。4 000 r/min离心10 min，弃上清，收集菌体，加入MS（附加200 μmol/L乙酰丁香酮）液体培养基中重悬20～30 min，稀释至OD600=0.4～0.6，备用。

1.4.2 茎段的预培养。

将苗龄15～20 d的马铃薯无菌瓶苗茎段切成长0.5～0.8 cm小段，置于预培养基中，20～25 ℃，避光培养2～3 d。预培养基选用愈伤诱导效果较佳的2.5 mg/L ZR+1.0 mg/L IAA+0.20 mg/L GA3激素配比培养基（表1 10号梯度）。

1.4.3 侵染及共培养。

预培后的茎段放入无菌培养皿（90 mm×90 mm）中，倒入农杆菌菌液，期间不断振荡，侵染8 min，茎段转入吸干纸上吸干表面残留菌液，接种于垫有滤纸的共培培养基中，20～25 ℃，避光培养2～3 d。选用激素配比为2.5 mg/L ZR+1.0 mg/L IAA+0.2 mg/L GA3（表1 10号梯度）作为共培培养基，并附加200 μmol/L乙酰丁香酮。

1.4.4 转化茎段的筛选及抗性芽的获得。

共培后将茎段转入筛选培养基中，20～25 ℃光照培养，每15～20 d换一次板，直至分化出抗性芽。选用2.0 mg/L ZR+0.1 mg/L IAA激素配比培养基（表1 7号梯度）作为筛选培养基，附加抑菌剂350 mg/L羧苄青霉素和卡那霉素。利用浓度梯度试验确定Kan最适浓度，设立5个浓度梯度（0、25、50、75、100 mg/L），每个梯度3个重复。20～25 ℃光照培养16 h，每15 d换一次板，观察第40天时外植体的筛选及出芽情况。

1.4.5 转化抗性植株的再生。

转化苗再生培养基为MS+30 g/L蔗糖+8 g/L琼脂+pH 5.8，附加不同激素浓度的NAA和IBA进行配比，30 mg/L Kan 和350 mg/L羧苄青霉素，根据预试验的结果设置5个处理（表2），将已分化出1～2 cm小苗，从基部切下，插入生根培养基中，每瓶5棵生根苗，每个梯度3个重复。观察转化抗性植株生根率（生根率=已长根植株数/总植株数×100%）及根长势情况。

1.4.6 转化植物的PCR鉴定。

待转化植株生根后，采用CTAB法提取DNA。未转化生根野生苗基因组DNA为阴性对照，植物表达载体质粒为阳性对照，利用Kan抗性基因NPTII的2个特异引物（5′→3′）CGTTGTCACTGAAGCGGGAGGG和GAGCGGCGATACCGTAAAGCAC进行PCR扩增。PCR反应体系为94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，94 ℃ 5 min，72 ℃ 8 min，35个循环，反应结束后4 ℃保温。PCR反应条件为 10 μL Mix+7.4 μL ddH2O+0.3 μL引物-F+0.3 μL引物-R+2 μL DNA，反应结束后用1.2%琼脂糖凝胶电泳进行检测。对检测结果进行统计和分析，计算该转化体系下的转化效率（转化率 =已检出Kan抗性的阳性植株数/总再生植株数×100%）。

2 结果与分析

2.1 不同激素配比对愈伤组织诱导及芽分化的影响

使用细胞分裂素6-BA和ZR，细胞生长素NAA和IAA，以及赤霉素GA3 3类植物激素，并根据前人研究结果，设计了5种激素不同浓度配比的13个处理梯度。结果表明，鄂马铃薯3号茎段可直接分化出芽（梯度1～3号除外），不同激素配比下的愈伤诱导和芽分化情况差异明显（表1）。

2种激素配比下（梯度1～7号），出愈率较高的是3号（2.0 mg/L 6-BA+0.10 mg/L NAA）和7号（2.0 mg/L ZR+0.1 mg/L IAA）2个处理，外植体茎段伤口处长出愈伤组织，呈绿色。3种和4种激素配比下（8～13号），出愈率明显高于2种激素配比，外植体茎段各部位均有愈伤长出，伤口处较多，呈浅绿色。

6-BA与NAA激素配比下未分化出芽，且与GA3配合使用时出芽率极低，分化出的芽较细，无明显叶片，表明6-BA不利于鄂马铃薯3号茎段的分化，但对愈伤组织的诱导能够起到一定的作用。ZR与GA3、IAA和6-BA多种激素配比（梯度8～13号）下出芽率均达100%，但所出芽较细，无明显叶片，苗弱；ZR与IAA配比（梯度6～7号）时能得到较高的出芽率，分化出的芽较粗，叶片较大且呈深绿色，苗壮，其中7号（2.0 mg/L ZR+0.1 mg/L IAA）出芽率可达100%。结果表明，ZR和GA3这2种配比其他激素时，可以促进鄂马铃薯3号茎段的分化出芽，但ZR诱导产生的芽较壮，GA3诱导产生的芽较弱。考虑操作的方便性、芽生长的状态、试验成本等，鄂马铃薯3号茎段愈伤诱导及分化出芽的最佳激素配比为2.0 mg/L ZR+0.1 mg/L IAA。