兴安杜鹃3种主要成分的HPLC测定及其对大鼠气管平滑肌的舒张作用

摘要 ［目的］建立同时测定兴安杜鹃中金丝桃苷、槲皮素和杜鹃素含量的高效液相色谱法（HPLC），并探讨兴安杜鹃提取物及3种主要成分对大鼠气管平滑肌舒张作用的影响及其作用机制。［方法］采用HPLC法测定兴安杜鹃中金丝桃苷、槲皮素和杜鹃素的含量并进行方法学考察。采用离体气管灌流法取大鼠气管环，将气管环固定于麦氏浴皿中，使用扑尔敏、吲哚美辛、格列苯脲、左旋硝基精氨酸甲酯（L-NAME）、硝苯地平和普萘洛尔进行预孵育，待气管环张力稳定后，加入60 mmol/L KCl溶液收缩气管环，进行兴安杜鹃对气管环的舒张试验，观察大鼠气管平滑肌张力变化。［结果］兴安杜鹃中3种主要成分HPLC测定方法考察结果显示，3种成分均在2～80 μg/mL线性关系良好，平均回收率分别为金丝桃苷100.3%（RSD=2.63%）、槲皮素102.7%（RSD=2.89%）、杜鹃素102.1%（RSD=2.36%）。在吲哚美辛、格列本脲和普萘洛尔孵育组织中，兴安杜鹃提取物及3种单体成分的舒张作用与未孵育组相比没有显著差异；在扑尔敏、L-NAME和硝苯地平孵育的组织中，兴安杜鹃及金丝桃苷与未孵育的组织相比有显著差异，舒张作用有所降低。这种现象可能是通过抑制组胺H1受体、一氧化氮合酶途径和钙离子通道介导的钙离子内流实现的。［结论］该试验建立的方法简单、准确，能快速测定兴安杜鹃中金丝桃苷、槲皮素和杜鹃素的含量，为其质量评价和控制提供了有效的分析手段；并且这3种成分与兴安杜鹃舒张气管的作用有关，可作为支气管扩张剂开发的理论依据。

关键词 兴安杜鹃；HPLC；金丝桃苷；槲皮素；杜鹃素；含量测定；气管平滑肌；舒张作用

中图分类号 R285  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2024）03-0163-08

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.03.040

HPLC Determination of Three Main Components of Rhododendron dauricum L. and Their Relaxing Effects on Rat Tracheal Smooth Muscle

Abstract ［Objective］To establish a method for the simultaneous determination of hyperin， quercetin and farrerol in Rhododendron dauricum by HPLC， and to discuss the effects of Rhododendron dauricum extract and its three main components on the relaxation of rat tracheal smooth muscle and the mechanism. ［Method］ The contents of hypericin， quercetin and farrerol in Rhododendron dauricum were determined by HPLC and the methodology was investigated. Rat tracheal rings were obtained by in vivo air tube perfusion method， and fixed in a Mack’s bath. The tracheal rings were pre-incubated with chlorphenamine， indometacin， glibenclamide， L-nitroarginine methyl ester （L-NAME）， nifedipine and propranolol. After the tension of the tracheal ring stabilized， 60 mmol/L KCl solution was added to shrink the tracheal ring. The relaxation experiment of tracheal ring by Rhododendron dauricum was conducted to observe the changes of tracheal smooth muscle tension in rats.［Result］The investigation results of the HPLC determination method for three main components in Rhododendron dauricum showed that the linear relationship between the three components was good in the range of 2-80 μg/mL. The average recovery rates were 100.3% （RSD=2.63%） of hypericin， 102.7% （RSD=2.89%） of quercetin and 102.1% （RSD=2.36%） of farrerol. The diastolic effects of the extract and the three main components of Rhododendron dauricum in the incubated tissue of indometacin， glibenclamide and propranolol were not significantly different from those in the unincubated group. The diastolic effects of Rhododendron dauricum and hypericin in the tissues incubated with chlorphenamine， L-NAME and nifedipine were significantly different from those in the unincubated tissues. This phenomenon may be achieved through inhibition of histamine H1 receptors， nitric oxide synthase pathways， and calcium channel mediated calcium influx.［Conclusion］ The established method is simple， accurate， and can quickly determine the content of hypericin， quercetin and farrerol in Rhododendron dauricum， providing an effective analytical means for quality evaluation and control. In addition， these three components are related to the effect of diastolic trachea of Rhododendron dauricum L.， and can be used as a theoretical basis for the development of bronchodilators.

Key words Rhododendron dauricum;HPLC;Hypericin;Quercetin;Farrerol;Content determination;Tracheal smooth muscle;Relaxation

兴安杜鹃（Rhododendron dauricum L.）属杜鹃花科杜鹃花属，为国家二级重点保护植物，其主要有效成分包括黄酮类、挥发油类和有机酸类等［1-3］。研究发现，兴安杜鹃具有镇咳、祛痰的临床作用，常应用于急性、慢性支气管炎、支气管哮喘等病症的治疗［4］。我国研究人员发现兴安杜鹃提取物、金丝桃苷、槲皮素、杜鹃素可以浓度依赖性舒张鼠胸主动脉［5-8］。支气管哮喘（bronchial asthma）简称哮喘，常以气道炎症反应为主要特征，气管平滑肌（tracheal smooth muscle，TSM）的收缩特性在哮喘发作中起重要作用［9］。兴安杜鹃在哮喘的临床治疗中应用较多［10-11］，但其作用机理仍不明确。为此，该研究建立兴安杜鹃3种主要成分含量测量方法，采用离体气管环灌流试验，考察兴安杜鹃提取物及3种主要成分对大鼠离体TSM张力的影响，并初步探讨兴安杜鹃舒张气管平滑肌的作用机制。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 仪器。

LC-20AT型高效液相色谱仪（Shimadzu公司）；H1650R型高速离心机（湘仪公司）；AB120型电子分析天平、DXY-6恒温加热水浴锅（SanLiang公司）；生物机能实验系统、ZH-HX-Z生物信号采集与分析系统、192203张力换能器（淮北正华生物仪器设备有限公司）；BT100蠕动泵（北京东南仪城）；麦氏浴皿（振华生物医药有限公司）；UP-400S超声波细胞破碎仪（上海熙扬仪器有限公司）。

1.1.2 药品与试剂。

兴安杜鹃叶购自北京同仁堂哈尔滨药房；扑尔敏、吲哚美辛（Indo）、格列苯脲（Gli）、左旋硝基精氨酸甲酯（L-NAME）、硝苯地平、普萘洛尔、茶碱，均购自上海Macklinl公司；金丝桃苷、槲皮素、杜鹃素，均购自成都Desite公司，纯度≥98%；甲醇，购自J&K Scientific；磷酸、甲基亚砜（DMSO）、氯化钾（KCl）、磷酸二氢钠（NaH2PO4）、氯化钠（NaCl）、碳酸氢钠（NaHCO3）、氯化钙（CaCl2）、氯化镁（MgCl2）、葡萄糖（Glucose），均购自天津市致远化学试剂有限公司。

1.1.3 实验动物。

清洁级SD雄性大鼠［12］ 60只，体重220～250 g，购自哈尔滨市双城区新兴镇见林养殖场，实验动物生产许可证号SCXK（黑）2019-001，饲养时光照周期为0.5 d明、0.5 d暗，期间自由饮水、进食。

1.2 试验方法

1.2.1 兴安杜鹃提取物的制备及其3种主要成分的含量测定。

1.2.1.1 兴安杜鹃样品溶液的制备。

取兴安杜鹃粉末（过60目筛）5 g，精密加入100%乙醇100 mL，采用超声细胞破碎提取法提取，重复2次，合并滤液。12 000 r/min离心10 min，取上清液进行HPLC检测。

1.2.1.2 标准品溶液的配制。

分别精确称取5 mg金丝桃苷、槲皮素、杜鹃素标准品，置5 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，配制成质量浓度为1 mg/mL的对照品储备液，于4 ℃保存。

1.2.1.3 HPLC条件。

采用HPLC分析兴安杜鹃中的3种主要成分。液相色谱柱为Diamonsil反相C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为甲醇（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脱（0～5 min，40%A；5～15 min，40%～50%A；15～20 min，50%～60%A；20～30 min，60%～65%A；30～40 min，65%A），在297和360 nm处同时检测，柱温30 ℃，进样量10 μL，流速为1.0 mL/min。

1.2.2 方法学考察。

1.2.2.1 线性关系考察。

将“1.2.1.2”中3种标准品溶液等比例混合，并用甲醇稀释为2、10、20、40、60、80 μg/mL，分别按“1.2.1.3”中HPLC条件测定（平行3次），以样品浓度和峰面积绘制标准曲线。

1.2.2.2 精密度试验。

将“1.2.1.2”中3种标准品溶液等比例混合，按照“1.2.1.3”中HPLC条件测定，单日内平行进样6组，得出3种主要成分峰面积的相对标准偏差（RSD）。

1.2.2.3 稳定性试验。

取室温放置的兴安杜鹃样品溶液，于48 h内不同时间进样，按照“1.2.1.3”中HPLC条件测定，得出3种主要成分峰面积的RSD。

1.2.2.4 重复性试验。

取6份“1.2.1.1”制备的兴安杜鹃样品溶液，按照“1.2.1.3”HPLC条件测定，得出3种主要成分峰面积的RSD。

1.2.2.5 加样回收率试验。

取3组已知兴安杜鹃含量的样品溶液，分别混入高、中、低浓度标准品溶液，按照“1.2.1.1”方法制备样品溶液，按照“1.2.1.3”中HPLC条件测定，得出3种主要成分的回收率及RSD。

1.2.2.6 样品含量测定。

将“1.2.1.1”制备的兴安杜鹃样品按照“1.2.1.3”中HPLC条件对3种主要有效成分进行测定，记录峰面积，计算兴安杜鹃样品中3种主要成分的含量。

52卷3期          张颖慧等 兴安杜鹃3种主要成分的HPLC测定及其对大鼠气管平滑肌的舒张作用