红树林植物内生菌分离鉴定及其抑菌活性研究

摘要  ［目的］从红树林植物组织中分离出对动物病原菌具有广谱抑菌活性的植物内生菌。［方法］以铜绿假单胞菌、多杀性巴氏杆菌、产气肠杆菌、粪肠球菌4种常见的致病菌作为指示菌，采用M10和P3培养基从红树林植物根、茎、叶组织中分离内生菌，以固体琼脂打孔法筛选具有抑菌活性的菌株，提取菌株的基因组DNA，PCR扩增16S rDNA基因并测序，通过邻接法构建系统发育树。［结果］从红树林植物组织中共分离857株可培养的内生菌，有145株菌有抑菌活性，占分离菌株的16.6%。其中通过M10培养基从红树林植物叶组织分离的菌株32-5对铜绿假单胞菌、产气肠杆菌都具有最强抑菌活性，其抑菌圈直径分别为38和42 mm；通过P3培养基从红树林植物茎组织分离的菌株12-4对粪肠球菌具有最强抑菌活性，其抑菌圈直径为56 mm；通过M10培养基从红树林植物茎组织分离的菌株13-2对多杀性巴氏杆菌具有最强抑菌活性，其抑菌圈直径为64 mm。有抑菌活性菌株分为10个属，其中芽孢杆菌属是优势菌属。［结论］该试验初步揭示红树植物根、茎、叶组织中植物内生菌的抑菌活性和多样性，为开发新型抗菌药物及应用提供理论依据。

关键词  红树林；植物内生菌；分离；鉴定；抑菌活性；海洋细菌

中图分类号  Q939.9  文献标识码  A

文章编号  0517-6611（2024）04-0001-10

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.04.001

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Isolation，Identification and Antibacterial Activity of Endophytic Bacteria from Mangrove Plants

XIE Xing.peng，DAI Yue，PENG Jin.ju et al

（Depariment of Veterinary Medicine，College of Coastal Agricultural Sciences，Guangdong Ocean University，Zhanjiang，Guangdong 524000）

Abstract  ［Objective］To isolate plant endophytes with broad.spectrum antibacterial activity from mangrove plant tissues.［Method］Pseudomonas aeruginosa，Pasteurella multocida，Enterobacter aerogenes and Enterococcus faecalis were selected as indicator bacteria.M10 and P3 solid medias and agar.well diffusion were used to isolate and screen endophytes with antibacterial activity from root，stem and leaf tissues of mangrove plants.Extracted DNA were used as template for PCR amplification of the 16S rDNA gene and sequenced to construct a phylogenetic tree by neighbor.joining method.［Result］A total of 857 culturable bacteria were isolated from mangrove plant tissues and 145 strains had inhibitory activity，accounting for 16.6% of the isolates.The strain 32.5，isolated from mangrove plant leaf tissue using M10 solid medium，had the strongest inhibitory activity against Pseudomonas aeruginosa and Enterobacter aerogenes，with an inhibition circle diameter of 38 mm and 42 mm，respectively.Strain 12.4 isolated from mangrove plant stem tissue using P3 solid medium showed the strongest inhibitory activity against Enterococcus faecalis with an inhibition circle diameter of 56 mm.Strains 13.2 isolated from mangrove plant stem tissues using M10 medium showed the strongest inhibitory activity against Pasteurella multocida with an inhibition circle diameter of 64 mm.Bacteria with antibacterial activity were classified into 10 genus，of which Bacillus was the dominant genus.［Conclusion］This experiment initially revealed the antibacterial activity and diversity of endophytic bacteria in mangrove plant roots，stems and leaf tissues，providing a theoretical basis for the development and application of new antibacterial drugs.

Key words  Mangrove;Plant endophytic bacteria;Separation;Identification;Bacteriostatic activity;Marine bacteria

基金项目  广东省自然科学基金项目（2023A1515012181）；湛江市科技局科技专项资金竞争性分配项目（2021A05231）；茂名实验室科研启动项目（2021TDQD002）。

作者简介  谢星朋（1999—），男，江西吉安人，硕士研究生，研究方向：兽医药理学与毒理学。*通信作者，教授，博士，硕士生导师，从事兽医药理学与毒理学研究。

收稿日期  2023-04-14

红树林是一种处在热带和亚热带交界地带的木本植物群落，是海洋与陆地两大生态系统的过渡区域，其独特的地理环境导致其中的微生物及其产物具有特殊性，红树植物内生菌复杂多样的代谢产物可成为重要的抗菌活性物质来源。目前，从红树林植物如木榄、秋茄、红海榄和海桑等宿主植物中均发现抗菌化合物［1-2］。随着陆地来源的药物研发难度不断加大，以“蓝色海洋药库”为资源库研制新药物已成为当今医药研究的重要方向。海洋微生物天然产物的研究最早是从海洋真菌开始的，海洋细菌天然产物的研究相对较晚。植物内生菌主要是指定殖于植物组织器官以及细胞间隙中的内生细菌［3］。研究显示，植物内生菌其特殊的代谢途径使其次级代谢产物可以产生大量结构新颖、抑菌效果较好的生物活性物质，成为开发新型抗微生物药物的良好资源［4-5］。该试验从广东湛江红树林自然保护区采取红树植物根、茎、叶样品，分离对动物病原菌有抑菌活性的内生菌，对其进行分子鉴定和系统发育分析，为开发新型抗菌药物及其在动物疫病防治领域的应用提供理论依据。

1  材料与方法

1.1  试验材料

1.1.1  培养基。M10培养基：可溶性淀粉10.0 g，水解酪素0.5 g，复合盐母液10 mL，琼脂14.0 g，去离子水1 000 mL，pH 7.2～7.4，复合盐母液溶解。P3培养基： 燕麦粉20.0 g，复合盐母液10 mL，琼脂14.0 g，去离子水1 000 mL，pH 7.2～7.4，复合盐母液溶解。

复合盐母液：KNO3 1.000 g，K2HPO4 0.500 g，NH4NO3  0.100 g，MgSO4·7H2O 0.500 g，NaCl 0.500 g，FeSO4 0.010 g，MnCl2·H2O 0.001 g，ZnSO4·7H2O 0.001 g，去离子水10 mL。LB液体培养基、LB固体培养基购自北京酷来博科技有限公司。

1.1.2  指示菌。

多杀性巴氏杆菌（批号CVCC393）、产气肠杆菌（批号ATCC13048）、粪肠球菌（批号ATCC29212）、铜绿假单胞菌（批号ATCC9027），均购自广东环凯微生物科技有限公司。

1.2  试验方法

1.2.1  样本采集。

从广东湛江红树林自然保护区采集红树植物根、茎、叶各50份，装于密封袋，室温保存。

1.2.2  样本的分组和处理。

将采集的红树植物组织根、茎、叶样品各50份随机排序标记。将样本植物清洗干净，依次用5%次氯酸钠、75%乙醇浸泡3 min，在消毒液浸泡后用无菌水冲洗多次。消毒完成后晾干，采用电动匀浆器将植物组织充分研磨，加入无菌水制成组织原液。

1.2.3  菌株培养与分离。

吸取植物组织原液0.1 mL均匀涂布到M10、P3培养基上，28 ℃培养7～21 d，挑选单菌落，进一步纯化分离后的菌株-80 ℃保存。

1.2.4  有抑菌活性菌株的筛选。

采用固体琼脂打孔法筛选红树植物根、茎、叶组织中有抑菌活性的菌株，将大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、链球菌4种指示菌分别加入LB固体培养基，用无菌打孔器打孔，将分离菌株培养过夜并用LB液体培养基稀释至105 CFU/mL，接种至孔中，28 ℃培养24 h，测量抑菌圈直径。

1.2.5  16S rDNA测序和系统发育树分析。

对筛选的有抑菌活性的菌株采用试剂盒提取细菌基因组DNA，进行16S rDNA序列PCR扩增。扩增的引物设计如下：上游引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′），下游引物1492R（5′-CTACGGCTACCT TGTTACGA-3′）。PCR扩增条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸45 s，30次循环；最后72 ℃延伸10 min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，委托上海生工生物工程股份有限公司进行测序分析。序列经BioEdit Sequence Alignment Editor软件整理后，利用EzBioCloud数据库（https：//www.ezbiocloud.net/）进行在线比对；选取同源性最高菌株的序列作为参比对象，运用MEGA10.0软件，采用Neighbor-Joining法构建系统发育树，Boostrap 1 000次检测各分支的置信值，对各菌株的系统发育地位进行分析。

2  结果与分析

2.1  分离菌株的抑菌效果

从红树植物根、茎、叶组织中分离出内生菌共857株，其中根227株，茎310株，叶320株。M10培养基共分离出具有抑菌活性菌株95株，从红树林植物根分离出具有抑菌活性菌株22株，如表1所示，菌株45-4对铜绿假单胞菌抑菌活性最强，菌株29-1对产气肠杆菌抑菌活性最强，菌株14-1对粪肠球菌和多杀性巴氏杆菌均表现出最强抑菌活性且呈现广谱抑菌效果；从红树林植物茎分离出具有抑菌活性菌株38株，如表2所示，菌株13-2对铜绿假单胞菌、粪肠球菌和多杀性巴氏杆菌均表现出最强抑菌活性且呈现广谱抑菌效果，菌株21-4对产气肠杆菌抑菌活性最强且具有广谱抑菌效果；从红树林植物叶分离出具有抑菌活性菌株35株，如表3所示，菌株32-5对铜绿假单胞菌和产气肠杆菌均表现出最强抑菌活性且具有广谱抑菌效果；菌株3-3对粪肠球菌具有最强的抑菌活性；菌株31-5对多杀性巴氏杆菌具有最强抑菌活性和广谱抑菌效果。