不同水稻品种OsVDAC8的表达模式比较与亚细胞定位分析

摘要  ［目的］研究OsVDAC8的理化性质和表达模式，为探究OsVDAC8的功能提供基础。［方法］用生物信息学分析OsVDAC8的结构特征及表达谱，然后通过定量PCR对3个不同水稻品种日本晴（NIP）、粤泰A（YTA）、粤泰B（YTB）不同发育时期的不同组织中OsVDAC8的表达模式进行分析，并通过BiFC对亚细胞定位进行验证。［结果］OsVDAC8编码区全长1 014 bp，编码337 aa，生物信息学分析结果显示，OsVDAC8是具有1个结构域的稳定的定位于线粒体的亲水蛋白，通过11次跨膜形成特异的桶状结构。在ATG上游含有13个与水稻生长发育及胁迫应答相关的顺式作用元件。RiceXPro和 MSU Rice Genome Annotation Project水稻基因表达数据库分析结果表明，NIP中OsVDAC8在生殖生长期的茎和花序出现前后幼穗中表达水平最高，在胚乳和根中的表达量较低。对NIP、YTA、YTB 3个水稻品种中OsVDAC8的表达谱分析结果显示，OsVDAC8在3个水稻品种四叶期的叶鞘表达水平都非常高，在花粉内容物充实期都很低，但幼穗发育的不同时期3个品种中表达水平差异很大，NIP中幼穗发育的整个时期表达量比较稳定，YTB中表达量较低，而在YTA幼穗发育的中后期表达水平逐渐下降。亚细胞定位结果显示，OsVDAC8定位于线粒体，与预测结果一致。［结论］OsVDAC8在3个水稻品种中表达模式不同，YTB中整个幼穗发育过程中表达量较低，YTA幼穗发育的中后期表达水平逐渐下降，而NIP中幼穗发育的整个时期表达量都比较稳定。OsVDAC8定位于线粒体。

关键词  水稻；OsVDAC8；表达模式；亚细胞定位

中图分类号  S511  文献标识码  A

文章编号  0517-6611（2024）04-0081-06

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.04.017

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Comparison of Expression Patterns in Different Rice Varieties and Subcellular Localization Analysis of OsVDAC8

JIANG Xiao.han，QIN Yong.hua，LIU Xue.qun et al

（Hubei Provincial Key Laboratory for Protection and Application of Special Plants in Wuling Area of China，Key Lab for Biotechnology of State Ethnic Affairs Commission，College of Life Science，South.Central University for Nationalities，Wuhan，Hubei 430074）

Abstract  ［Objective］To study the physical and chemical properties and expression patterns of OsVDAC8 for providing a basis for further investigation of the function of OsVDAC8.［Method］The structural characteristics and expression profile of OsVDAC8 were analyzed by bioinformatics.The expression patterns of OsVDAC8 in different tissues of three rice varieties，Nipponbare （NIP），Yuetai A （YTA） and Yuetai B （YTB） at different developmental stages were analyzed by quantitative PCR，and the subcellular localization was verified through BiFC.［Result］There were 1 014 bp and encodes 337 aa in the OsVDAC8 coding region.The results of bioinformatics analysis showed that OsVDAC8 is a stable hydrophilic protein with one domain localized to mitochondria，and forms a specific barrel.like structure through 11 transmembrane.There are 13 cis.acting elements related to rice growth and development and stress response in the upstream of ATG.Analysis via rice XPro and MSU Rice Genome Annotation Project rice gene expression database showed that  OsVDAC8 was expressed in the stem and panicle before and after the appearance of inflorescences during the reproductive growth period，and the expression was low in the endosperm and root in NIP.The expression profile analysis of OsVDAC8 in three rice varieties NIP，YTA and YTB  showed that the leaf sheath expression level of OsVDAC8 was very high in the four.leaf stage of the three rice varieties and very low in the pollen content enrichment stage，but very different in the three rice varieties at different stages of young panicle development.In NIP，the expression level was relatively stable during the whole stage of young panicle development，while in YTB，the expression level was low，and in YTA，the expression level decreased gradually during the middle and late stage of young panicle development.The subcellular localization results showed that OsVDAC8 was localized to mitochondria，which was consistent with the prediction results.［Conclution］The expression patterns of OsVDAC8 were different in different rice varieties.OsVDAC8 was localized to mitochondria.

Key words  Rice;OsVDAC8;Expression pattern;Subcellular localization

基金项目  国家自然科学基金项目（31170226 ）。

作者简介  蒋晓涵（1999—），女，湖北荆门人，硕士研究生，研究方向：分子遗传学。*通信作者，教授，博士，硕士生导师，从事分子遗传学研究。

收稿日期  2023-03-19

电压依赖性阴离子通道 （VDAC）是定位于线粒体外膜的主要转运蛋白，最初从酵母中分离出来，存在于从真菌到动物和植物的所有生物体中［1］。哺乳动物和昆虫 VDAC是一个由19条反向平行反向链组成的桶状结构，其中N端螺旋折叠到孔中［2］。所有生物体的VDAC具有相似的基本电生理特性（电导、选择性和电压依赖性）［3］。线粒体和细胞质之间的无机离子和代谢物的交换对于许多线粒体功能是必不可少的。多种转运蛋白（离子通道、载体和ABC转运蛋白）介导通过线粒体内膜（MIM）的选择性转运［4］。相比之下， VDAC是线粒体外膜（MOM）中多种化合物的主要转运途径，如无机离子（如K+、Na+和Cl-）、代谢物（如ATP和AMP）和大分子（如tRNA）等［5］。VDAC的开放状态对多价阴离子代谢物（如ATP）具有阴离子选择性和渗透性。而VDAC的关闭状态使通道有阳离子选择性。然而，通道仍然具有足够的电导性，可以传输小离子［6］。VDAC的开放/关闭对机体的细胞器代谢具有重要的调节作用。除了调节代谢物转运的功能外，VDACs还参与了细胞的程序性死亡［7］。

植物VDAC不仅参与植物发育过程，还参与环境应激反应［8］。拟南芥 AtVDAC2和AtVDAC4中的T-DNA插入敲除突变导致成熟叶片的生长严重迟缓。除atvdac3外，所有敲除突变体的花粉粒数、花粉发芽率和发芽花粉管长度均显著降低［9］。AtVDAC1 能调节拟南芥对农杆菌感染的能力［10］，AtVDAC2参与盐胁迫反应途径［11］。小麦TaVDAC1 的过表达（OE）增强了转基因拟南芥对盐胁迫的耐受性并降低了对干旱的抗性［12］。AtVDAC3 和硫氧还蛋白m2（AtTrx m2）之间存在相互作用均调节ROS的积累，且 AtVDAC3 的过表达增加了H2O2的积累，而AtTrx m2的过表达减少了NaCl处理中H2O2的积累［13］。因此，植物VDACs在调节植物生长及应对压力方面发挥关键作用［14］。

通过水稻全基因组扫描鉴定出了8个OsVDAC 基因［15］，并利用生物信息学网站分析了OsVDAC1-8基因精细结构［16］。OsVDAC3在生殖生长期的茎、花序出现前后幼穗及雄蕊成熟花粉中表达水平最高，OsVDAC3的表达可能与雄性的育性相关［17］。OsVDAC5在水稻各个部位不同时期均有高表达［18］， OsVDAC6可能与水稻耐盐和耐旱有关［19］；osvdac4纯合突变体幼苗对ABA胁迫具有更好的抗性［20］。OsVDAC家族中OsVDAC8鲜见报道。笔者通过生物信息学方法分析其表达谱、预测其顺式作用元件，并以3个水稻品种（日本晴、红莲型不育系粤泰A和保持系粤泰B）不同发育时期幼穗以及四叶期幼苗根、鞘和叶为材料，对OsVDAC8基因表达模式进行分析，旨在为研究OsVDAC8的功能提供参考。

1  材料与方法

1.1  材料

水稻品种日本晴（NIP）、红莲型不育系粤泰 A（YTA）及保持系粤泰 B（YTB）种子，HBT-GFP质粒、DH5α菌株均来源于中南民族大学生物技术国家民委重点实验室。

1.2  生物信息学分析

1.2.1  OsVDAC8蛋白的理化性质。使用线上工具ExPASy－Protparam（https：//web.expasy.org /protparam/）进行理化性质分析，Protscale线上软件（https：//web.expasy.org/protscale/）进行亲水性、疏水性分析，CDD软件（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）进行蛋白保守功能区分析，SOPMA（https：//npsa.prabi.ibcp.fr/cgi.bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）进行蛋白二级结构分析，Swissmodel（https：//www.expasy.org/resources/swiss-model）进行蛋白三级结构预测，Cell-PLoc 2.0（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/）行蛋白亚细胞定位分析。

1.2.2  顺式作用元件预测。

在 NCBI数据库下载 OsVDAC8（Chr3 LOC_Os03g20750）起始ATG前5 000 bp的DNA序列，利用PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）在线分析预测顺式作用元件。

1.2.3  表达模式分析预测。

从水稻 4-44K基因表达芯片RAPDB中提取NIP OsVDAC8（Chr3 LOC_Os03g20750）在不同生长发育阶段不同组织中的表达谱（RiceXPro，http：//ricexpro.dna.affrc.go.jp/）［21］，通过Hierarchical cluster分析［22］使用MeV （MultiExperiment Viewer）表示基因的表达模式。在MSU Rice Genome Annotation Project水稻基因表达数据库中 （http：//rice.plantbiology.msu.edu/expression.shtml）下载基因的表达数据，用omega作图软件绘图分析基因的表达模式。