湛江地区罗非鱼病原菌分离鉴定及毒力基因检测

摘要  ［目的］了解湛江市某水产养殖场患病罗非鱼病原菌携带毒力基因情况。［方法］从10尾患病罗非鱼心脏、肠道、脾、肝脏等器官分离细菌，提取分离纯化细菌的总DNA，PCR扩增16S rDNA基因后经过基因测序鉴定细菌，并利用PCR技术检测分离菌株的毒力基因。［结果］从罗非鱼内脏中分离的细菌为华纳葡萄球菌、大肠杆菌和粪肠球菌，在毒力基因检测中发现华纳葡萄球菌携带毒力基因gap，大肠杆菌携带毒力基因pap、afa，粪肠球菌携带毒力基因efaA、cylM、cylB。［结论］该研究结果可为湛江地区罗非鱼细菌性疾病防控提供理论依据。

关键词  罗非鱼；病原菌；纯化；分离与鉴定；毒力基因

中图分类号  S941  文献标识码  A  文章编号  0517-6611（2024）05-0096-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.05.023

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Isolation， Identification and Virulence Gene Detection of Pathogenic Bacteria from Tilapia in Zhanjiang Area

LUO Shuai-shuai， DING Yue-xia， LIAO Cui-yi et al

（Department of Veterinary Medicine， Binhai Agricultural College， Guangdong Ocean University， Zhanjiang， Guangdong 524088）

Abstract  ［Objective］ In order to understand the virulence genes carried by the pathogenic bacteria of diseased tilapia in an aquaculture farm in Zhanjiang City. ［Method］ The experiment isolated bacteria from 10 diseased tilapia organs such as heart， intestine， spleen， liver， etc.， and the total DNA of bacteria was extracted and purified. After PCR amplification of 16S rDNA gene， the bacteria were identified by gene sequencing， and the virulence genes of the isolated strains were detected by PCR technology. ［Result］ The results showed that the bacteria isolated from tilapia viscera were Staphylococcus warneri， Escherichia coli and Enterococcus faecalis. In the virulence gene detection， it was found that Staphylococcus warneri carried the virulence gene gap;Escherichia coli carried the virulence genes pap and afa;Enterococcus faecalis carried the virulence genes efaA， cylM， and cylB. ［Conclusion］ The research results can provide theoretical basis for the prevention and control of bacterial diseases of tilapia in Zhanjiang area.

Key words  Tilapia;Pathogenic bacteria;Purification;Isolation and identification;Virulence genes

基金项目  广东省教育厅2021年度普通高校重点领域专项（2021ZDZX-4003）；湛江市科技局2021年度省科技专项资金（“大专项+任务清单”）竞争性分配项目（2021A05231）；茂名实验室科研启动项目（2021TDQD002）。

作者简介  罗帅帅（1998—  ），男，陕西榆林人，硕士研究生，研究方向：兽医药理学与毒理学。

*通信作者，教授，博士，硕士生导师，从事兽医药理学与毒理学研究。

收稿日期  2023-04-10

水产养殖业是获得动物蛋白的重要来源之一，水生动物中含有多种必需氨基酸和高度不饱和脂肪酸［1］。罗非鱼具有生长快、繁殖力强、食性杂、病害少、抗病力强、适应性强、肉质厚、骨刺少等特点，而且含有丰富的不饱和脂肪酸，是我国水产养殖中的一个重要品种［2］。水产养殖对产量的过高追求往往导致养殖密度过高，超出了水体的承载能力，从而导致养殖环境恶化，罗非鱼的病害发生率明显增加［3］。细菌性疾病是制约罗非鱼养殖的重要因素之一［4］。大肠杆菌、华纳葡萄球菌和粪肠球菌是水产动物的常见条件致病菌［5-8］。大肠杆菌可导致虹鳟鱼发病，病鱼表现出的症状为体色发黑，鳃丝苍白或粉红，肛门及有的鳍条充血，内脏肠、肝、脾等充血和出血［9-10］。葡萄球菌感染致病造成病鱼鱼眼突出的比例达75%，与链球菌病症状极其相似［11］。细菌的致病性机理研究主要通过对细菌的毒力基因进行识别，并对其在寄生过程中的特异性表达进行筛选，从而了解其与病原菌的毒性关系［12］。该试验旨在分离鉴定罗非鱼病原菌以及探究其毒力基因，为湛江地区罗非鱼细菌性疾病防控提供理论依据。

1  材料与方法

1.1  材料

1.1.1  试验动物。

湛江市某水产养殖场10尾患病罗非鱼。

1.1.2  试剂。

脑心浸液肉汤培养基、营养肉汤琼脂培养基购自广东环凯生物有限公司；Taq酶、溶菌酶购自Takara公司；细菌基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技有限公司；引物购自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2  方法

1.2.1  病原菌分离。

取病鱼的心脏、肠道、脾、肝脏等器官，剪成小块，置于无菌脑心浸液营养肉汤中，37 ℃恒温培养24 h。在营养琼脂平板上划线，在37 ℃下培养24 h。根据所形成的菌群形态特点筛选出不同的菌株，进行分离纯化。

1.2.2  病原菌的初步鉴定。

每种细菌挑单菌落，对其进行稀释、涂片、固定、染色后，在显微镜下观察菌体颜色及形态。

1.2.3  16S rDNA基因测序。

将分离的细菌用脑心浸液营养肉汤培养，37 ℃培养24 h。参考Omega细菌DNA试剂盒（D3350-01）的说明书提取菌株基因组DNA，采用PCR扩增16 S rDNA。扩增引物为：上游引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′），下游引物1492R（5′-CTACGGATCC TGGCTCAG-3′）。PCR反应体系为：1.0 μLDNA模板，上下游引物各0.5 μL，Taq酶13.0  μL。PCR反应条件为：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，62 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，30次循环，72 ℃延长10 min，4 ℃贮存。1%琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行检测，送生物技术公司测序。用NCBI的Blast对测得的基因序列进行比较，通过MEGA 10.0程序，利用Neighbor-Joining方法构建系统树，用1 000个自举法检测系统树中各个分支的可信度。

1.2.4  毒力基因检测。

毒力基因引物序列、退火温度和片段大小见表1，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。用PCR法扩增目标基因，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。

2  结果与分析

2.1  分离菌镜检结果

镜检结果显示，菌株①为革兰氏阳性球菌，呈葡萄串状排列；菌株②为革兰氏阴性杆菌，呈短杆状；菌株③为革兰氏阳性球菌。

2.2  16S rDNA基因系统发育分析

根据16S rDNA测序结果，应用MAGAX软件对3株细菌进行系统发育树分析。3株菌分为3个属，分别是葡萄球菌属、肠杆菌属、肠球菌属。邻接树显示，菌株①与葡萄球菌属的16S rDNA基因序列同源性达到了96%；菌株②与肠杆菌属聚到一起的置信度高达98%；菌株③与肠球菌属聚到一起的置信度为100%。在BLAST上进行序列比对结果可知菌株①为华纳葡萄球菌，菌株②为大肠杆菌，菌株③为粪肠球菌。

2.3  毒力基因检测结果

毒力基因PCR产物电泳结果如图1所示，毒力基因irp2、CS31A、seo、sea、TSST-1、ermC、aggA及gelE均没有扩增出条带，表明3株菌未携带以上毒力基因；afa、pap、gap、cylB、cylM和efaA各有一条特异性条带，所扩增的片段大小与相应毒力基因片段大小相同，表明上述细菌的毒力基因检测呈阳性。fimH基因扩增出片段大小与目的基因片段大小不符，判断为阴性。3株试验菌毒力基因携带情况为：华纳葡萄球菌携带gap，大肠杆菌携带pap、afa，粪肠球菌携带efaA、cylM、cylB。

3  讨论

葡萄球菌是一种革兰氏阳性菌，主要有金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌等［13］。李晓陀等［14］对患病罗非鱼的鱼苗胆囊和肝部细菌分离鉴定结果表明，分离菌株主要为革兰氏阴性菌，鉴定为嗜水气假单胞菌，少量革兰氏阳性菌为沃氏葡萄球菌。杨宪时等［15］从罗非鱼鱼肉中分离的细菌以假单胞菌为主，革兰氏阳性菌较少，以沃氏葡萄球菌、沃氏小球菌为主。以上报道说明葡萄球菌在水产动物体内普遍存在，该试验从患病罗非鱼中分离出了华纳葡萄球菌。

大肠杆菌是一种常见的动物肠道细菌，通常不会引起疾病［16］。一些特定的血清型大肠杆菌在一定环境下会导致肠道和外部的感染［17-18］，Yang M X等［19］报道大肠杆菌会诱导草鱼红细胞铁死亡。致病性大肠杆菌含有多个毒力因子，毒力基因携带情况与其致病性的强弱有密不可分的联系［20］。按其毒性效应，可分为黏附素、铁摄取、毒素、脂多糖、侵袭素和血清抗性因子等［21］。黏附素能使细菌在宿主细胞的表面上定植，是大肠杆菌入侵人体的一个重要步骤。黏附素包括革兰氏阴性菌的菌毛（pap）和无菌毛黏附素（afa）［22］。该试验对从患病罗非鱼的肝脏中分离鉴定出的大肠杆菌进行检测，检出pap、afa等毒力基因与Ewers C等［23］检测出禽源大肠杆菌的毒力基因主要是yijp、fimC、mat等，可见毒力基因的分布可能与物种来源有一定的关系，大肠杆菌对不同物种的侵袭可能是不同毒力因子导致的。

粪肠球菌是人和动物胃肠道的正常菌群［24］，具有维持正常肠道菌群结构的重要作用，是一种条件致病菌［25］，粪肠球菌的致病能力与其表达出来的毒力因子有关［26-27］。粪肠球菌携带毒力基因efaA、cylM、cylB。efaA是一种脂蛋白，其致病力在粪肠球菌的动物模型中得到了验证［28］。狄婷婷等［29］报道指出Cyl编码基因包括：激活基因CyLA、转运基因CyLB、结构基因CyL1和CyLS、修饰基因CyLM、免疫基因CyLI。细胞溶解素既可溶解某些G+细菌，还能对红细胞和其他真核细胞膜产生破坏，导致胞浆膜上出现小孔、破裂，小分子物质外泄，对宿主细胞产生损害，是肠球菌感染的主要致病因子，能引起肠球菌的感染［30］。该试验从粪肠球菌中检测出efaA、cylM、cylB 3种毒力因子，表明毒力因子的致病过程是多种毒力因子共同作用于宿主细胞导致的。