高效氟氯氰菊酯降解菌的分离与降解特性研究

摘要 ［目的］筛选降解高效氟氯氰菊酯（β-CF）的微生物菌种资源，并研究其降解特性。［方法］利用梯度压力驯化法，从曾使用拟除虫菊酯类杀虫剂的土壤中富集筛选降解β-CF的候选菌株，通过形态学和基于16S rRNA基因序列系统发育分析鉴定其分类地位，采用单因素试验研究菌株对β-CF的耐受性和降解特性。［结果］筛选获得1株以β-CF为唯一碳源生长、环境适应能力强的细菌GM4，经鉴定该菌为嗜油不动杆菌（Acinetobacter oleivorans）。菌株GM4对β-CF的耐受浓度可以达到600 mg/L，在初始浓度50 mg/L、pH 8.0、接菌量10%、温度28 ℃条件下培养48 h后，对β-CF降解率为99.44%。［结论］菌株GM4能高效降解β-CF，是环境中β-CF类农药残留生物修复的优良种质资源。

关键词 高效氟氯氰菊酯；降解菌；分离；耐受性；降解特性

中图分类号 X 172  文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2024）06-0001-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.06.001

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Isolation and Degradation Performance of a Beta-cyfluthrin-degrading Strain

ZHANG Jing-yi，PENG Qing-zhong，YI Lang-bo

（School of Biological Resources and Environmental Sciences，Jishou University，Jishou，Hunan 416000）

Abstract ［Objective］To screen the highly efficient degradation strains of beta-cyfluthrin （β-CF），and study their degradation characteristics.［Method］Gradient pressure acclimation was used to enrich and screen candidate strains for degradating β-CF from soil that had been used pyrethroids，and the taxonomic status was identified by morphological characteristics and phylogenetic analysis based on 16S rRNA gene sequence.The tolerance and degradation characteristics of candidate strains to β-CF were investigated by single-factor experiments.［Result］A dominant strain GM4 with strong environmental adaptability was obtained by screening，and the strain was identified as Acinetobacter oleivorans.The tolerance concentration of strain GM4 to β-CF could reach 600 mg/L，and the degradation rate of β-CF was 99.44% after the initial concentration of 50 mg/L，pH 8.0，inoculation amount of 10%，and temperature of 28 °C for 48 h.［Conclusion］The GM4 strain can efficiently degrade β-CF，which is an excellent germplasm resource for the bioremediation of pesticide residues of β-CF in the environment.

Key words Beta-cyfluthrin;Degrading strain;Isolation;Tolerance;Degradation characteristic

农药作为重要的农业生产资料，在减少农作物损失、保障粮食产量安全上贡献巨大［1］。中华人民共和国国家统计局资料显示，2019年我国使用农药总计137.19万t［2］。拟除虫菊酯是通过模仿天然除虫菊素化学结构人工合成的一类杀虫剂［3-4］，具有高效、杀虫谱广等特点，在我国西北和华北等地广泛应用，其产量占据全球农药类总产量的20%［5］。高效氟氯氰菊酯（beta-cyfluthrin，简称β-CF）是新一代 Ⅱ 型含α-氰基的高效广谱拟除虫菊酯类杀虫剂［6］，作为应用最广泛的菊酯类杀虫剂之一，主要用来防治蚜虫、蓟马等害虫，同时能兼治蜱螨［7］。但是 Ⅱ 型菊酯农药普遍具有光、热稳定等特点，在环境中半衰期较长，自然环境条件下很难降解，在固相、液相、气相中的循环易引发环境中农药的残留，2009—2011年的一份研究报告表明，美国北卡罗来纳州50名成年人的782份固体食物中氟氯氰菊酯的检出率达6%［8］；2017—2019年对北京大兴区主产水果农药残留现状监测，主要残留的菊酯类农药包括氟氯氰菊酯，且在葡萄和西瓜的使用最为广泛［9］。研究表明，水中浓度为10 ng/L的β-CF等菊酯类农药就可杀死全部无脊椎生物［10］，同时也会对非目标靶性生物如家蚕、蜜蜂等益虫造成影响［11］。β-CF等菊酯类农药含有卤素基团具有脂溶性，易被人体呼吸道和胃肠道吸收［12］，对人与哺乳动物具有神经毒性［5］、生殖毒性和免疫毒性［13-14］等。越来越多的研究证明其对生态环境和人类健康具有较高的潜在风险。2020年7月欧盟发布了β-CF的正式禁用公告［15］。

微生物降解作为一种安全、有效的农药残留消除手段，逐渐成为农药环境污染的主要修复方式。研究表明环境中蕴藏着很多能够降解拟除虫菊酯类农药的细菌、真菌等微生物，如Bhatt等［16］从广西某农药厂排污口污泥中分离获得1株鞘氨醇单胞菌（Sphingomonas trueperi），在30 ℃、pH 7.0条件下培养96 h，对100 mg/L的丙烯菊酯降解效率达93%；王若瑜等［17］从发酵大曲中分离到的玫瑰红红球菌（Rhodococcus rhodochrous），其对质量浓度为5 mg/L的氯氟氰菊酯降解率可达71.44%；陈锐等［18］从土壤中分离得到1株高效分解菊酯类农药的微生物菌株SSCL-3，经鉴定该菌为米曲霉（Aspergillus oryzae），该菌在无机盐培养基摇瓶培养24 h，对500 mg/L 高效氯氰菊酯的降解率可达88.9%。目前，关于拟除虫菊酯类农药降解菌的筛选和农药残留的生物修复主要集中在联苯菊酯［19］、丙烯菊酯、氯氰菊酯等老牌菊酯类农药，对β-CF这类高活性新型菊酯类农药降解菌的研究较少，急需发掘降解这类新型菊酯类农药残留的微生物资源。基于此，该研究以β-CF为唯一碳源，从使用过拟除虫菊酯农药的果园、耕地土壤中富集分离降解β-CF的细菌，通过形态特征和16S rRNA基因序列分析进行鉴定，并研究其降解特性，旨在为β-CF等拟除虫菊酯农药残留的生物修复积累种质资源提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验试剂。β-CF原药（纯度95%）购自广东立威化工有限公司；β-CF标准品购自北京北方伟业计量技术研究院；甲醇（色谱级）和丙酮（分析纯）购自天津市科密欧化学试剂有限公司；TaqDNA聚合酶与各种限制性内切酶均购自生工生物工程（上海）股份有限公司。试验用水为Milli-Q超纯水。

1.1.2 试验仪器。Applied Biosystems MiniAmp PCR仪（中国赛默飞世尔科技有限公司）；Eppendorf Centrifuge 5424离心机（德国艾本德股份公司）；T6紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限公司）；LC-20A高效液相色谱仪（日本岛津公司）；Eyela-1100真空旋转蒸发仪（东京理化器械株式会社）；IS-RDV1恒温振荡培养箱（美国精骐有限公司）。

1.1.3 样品。

样品采自湖南省永顺县曾使用拟除虫菊酯类虫剂的果园和耕地（28°54′11″N，110°4′12″E），共收集土壤样本6份，于无菌袋中密封，-80 ℃冰箱保存备用。

1.1.4 培养基。LB液体培养基：蛋白胨10 g、NaCl 10 g、酵母膏5 g、pH 7.0，蒸馏水定容至1 000 mL，121 ℃，灭菌20 min；固体培养基中加入15 g的琼脂。富集培养基：NaCl 2.0 g、NH4NO3 5.0 g、K2HPO4 1.0 g、KH2PO4 1.0 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、酵母膏1.0 g、pH 7.0，蒸馏水定容至1 000 mL，121 ℃，灭菌20 min，添加β-CF丙酮母液至最终浓度依次为100、200、300、400和500 mg/L。液体选择培养基：NaCl 2.0 g、NH4NO3 5.0 g、K2HPO4 1.0 g、KH2PO4 1.0 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、pH 7.0，蒸馏水定容至1 000 mL，121 ℃，灭菌20 min，添加β-CF丙酮母液至最终浓度为500 mg/L；固体培养基中加入1.5%的琼脂。

1.2 试验方法

1.2.1 β-CF降解菌的富集与分离。

称取土样10 g加入装有90 mL无菌水的250 mL锥形瓶中，于28 ℃、150 r/min 振荡2 h，静置30 min，取上清液，按1%接菌量（体积比）接种至含100 mg/L β-CF农药的富集培养基中，恒温振荡（28 ℃，150 r/min）培养5 d，转接至β-CF浓度提高100 mg/L的新鲜富集培养基中继续培养5 d，如此驯化，直至β-CF浓度提高至500 mg/L时振荡培养5 d，驯化结束。

按1%接菌量取驯化液接种至β-CF为唯一碳源的液体选择培养基中，继续培养5 d，转接2次，取50 μL培养液涂布在固体选择培养基上，于28 ℃恒温培养箱培养48 h，待菌落长出，选取不同形态特征的单菌落，四分体划线纯化培养，转接3次。对筛选出的优势菌株置于20%的甘油管中于-80 ℃保存备用。

1.2.2 分离菌株的形态观察与分子鉴定。

1.2.2.1 菌株的形态观察。

取单菌落在LB固体培养基和固体选择培养基上划线，于28 ℃培养24 h，观察菌落生长情况和形态特征。收集纯化后的新鲜菌体至1.5 mL EP管中，用0.9%的NaCl溶液漂洗菌体2～3次，5 000 r/min离心3 min，去上清后加入1 mL浓度为2.5%的戊二醛溶液，轻摇充分混匀，重悬菌液，置于4 ℃冰箱过夜固定，待镜检。

1.2.2.2 基于16S rRNA基因序列的系统发育分析。

使用细菌基因组DNA快速抽提试剂盒提取分离菌株基因组DNA，以其为模板，采用16S rRNA基因通用引物（PA5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；PB5′-TTAAGGTGATCCAGCCGCA-3′）PCR扩增目的片段，反应循环参数如下：95 ℃预变性2.5 min，95 ℃变性15 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35个循环，72 ℃继续延伸10 min。PCR产物由生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。

将获得的16S rRNA基因片段（序列长度约1 500 bp）测定结果在NCBI数据库中进行Blast比对，在数据库中下载关系密切的菌株16S rRNA基因序列，使用MEGA 7.0软件采用邻接法（neighbor-joining）进行聚类分析和系统发育树构建。