低温环境下野外自然好氧堆肥理化特征及微生物群落结构变化

摘要 ［目的］研究低温环境下野外自然好氧堆肥理化特征及微生物群落结构变化，实现低温季节养殖废弃物的资源化利用。［方法］以猪粪和稻壳为原料在低温环境下进行自然好氧堆肥处理，对堆肥过程中温度、pH、含水率、NH+4-N、NO-3-N和种子发芽指数（GI）进行分析，选取细菌16S rDNA V3～V4区和真菌ITS序列进行高通量测序，比较好氧堆肥过程中不同阶段微生物群落多样性及组成差异。［结果］当环境温度为-6.7～6.4 ℃时，整个堆肥过程高温阶段持续11 d，经过38 d的好氧堆肥处理，堆体含水率、pH、NH+4-N、NO-3-N等指标均趋于稳定，堆肥结束时GI达到了122.12%，表明堆肥产品完全腐熟。低温条件下堆肥不同阶段样本微生物群落分析表明，Acinetobacter是堆肥初期和升温阶段优势细菌属，而Pseudofulvimonas和Ensifer在堆肥高温阶段丰度最高，Parapedobacter为堆肥末期优势细菌属。Ascobolus是堆肥初期优势真菌属，而Mycothermus为好氧堆肥升温、高温和腐熟阶段的优势菌群。细菌群落功能预测结果表明，氨基酸转运和代谢、碳水化合物运输和代谢等是堆肥过程中细菌的主要代谢功能。理化指标与微生物多样性相关性分析表明，堆肥过程中pH与属水平上丰度较高的微生物相关性强，含水率、温度、NH+4-N和发芽指数次之。［结论］低温条件下野外自然好氧堆肥可顺利进行并完全腐熟，这为低温环境下野外自然好氧堆肥提供了依据。

关键词 好氧堆肥；低温环境；理化特征；高通量测序；群落结构；功能预测

中图分类号 X713  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2024）06-0051-09

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.06.013

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Changes of Physico-chemical Characteristics and Microbial Community Structure During Natural Aerobic Composting Under Low Temperature Environment in the Field

ZENG Qiao1，2， SHI Chun-yang1，2， LI Jun3 et al

（1.School of Food and Biological Engineering，Shaanxi University of Science&Technology，Xi’an，Shaanxi 710021;2.Shaanxi Research Institute of Agricultural Products Processing Technology， Xi’an，Shaanxi 710021;3.Xi’an Agricultural Technology Extension Center，Xi’an，Shaanxi 710061）

Abstract ［Objective］To study the changes of physico-chemical characteristics and microbial community structure during natural aerobic composting under low temperature in the field，realize the resource utilization of breeding waste in low temperature season.［Method］Using pig manure and rice husk as raw materials for aerobic composting in the field， the temperature， pH， water content， NH+4-N， NO-3-N and germination index （GI） of seeds during composting process were analyzed， the bacterial 16S rDNA V3-V4 region and fungal ITS region were further selected for high-throughput sequencing.The diversity and composition of microbial communities in different stages of aerobic composting process were compared.［Result］When the environmental temperature was -6.7-6.4 ℃， the high-temperature stage of the entire composting process lasted for 11 days. After 38 days of aerobic composting treatment，the moisture content， pH， NH+4-N， NO-3-N and other indicators of the pile tended to be stable. At the end of composting， the GI reached 122.12%， indicating that the compost product was completely decomposed.The analysis of microbial communities in samples from different stages of composting under low temperature conditions showed that Acinetobacter was the dominant bacterial genus in the early and heating stages of composting， Pseudofulvimonas and Ensifer had the highest abundance in the high temperature stage of composting， and Parapedactor was the dominant bacterial genus in the late stage of composting. Ascobolus was the dominant fungal genus in the early stages of composting， while Mycothermus was the dominant microbial community in the heating， high temperature and maturation stages of aerobic composting.The predicted results of bacterial community function showed that amino acid transport and metabolism，carbohydrate transport and metabolism et al were the main metabolic functions of bacteria in composting process.The correlation analysis between physicochemical indexes and microbial diversity showed that the pH and genus abundance were highly correlated， followed by water content， temperature， NH+4-N and GI.［Conclusion］Natural aerobic compost can be carried out smoothly and completely decomposed in the field under low temperature conditions，it provide a basi for natural aerobic composting in the field under low temperature environment.

Key words Aerobic composting;Low temperature;Physico-chemical characteristics;High-throughput sequencing;Community structure;Function prediction

近年来，随着我国人民生活水平的提高，对肉蛋奶等畜禽产品的需求量不断增长，畜禽养殖业朝着集约化、工厂化、规模化方向迅速发展，从而导致畜禽粪便的排放量不断增加。我国是世界上最大的畜禽养殖国，每年产生的畜禽粪便废弃物高达40亿t［1］，而规模化养殖场中有90%以上都缺乏必要的粪污治理措施，农村也存在大量未经处理的畜禽粪便被随意处置和排放的现象，这不仅浪费了大量的养分资源，而且给环境带来了极大的压力。

好氧堆肥处理是实现畜禽粪便无害化和资源化利用的一个重要途径，经过好氧堆肥处理，其发酵产物施用于土壤不仅可以增加土壤肥力，提高土壤保水、透气的能力，还可以调节土壤中微生物菌群种类和数量，从而改善土壤结构，推进农业提质增效，同时避免了畜禽粪便低质量处理所导致的环境问题。野外自然好氧堆肥堆体适中，易于操作，不需要额外添加菌剂，适用于农村较为分散的农户对在畜禽养殖和农业生产过程中产生的废弃物进行资源化利用。环境温度对好氧堆肥进程有较大的影响，环境温度高，堆肥过程启动快，堆肥效率也较高。我国地域辽阔，北方地区冬季时间长，温度低，但是有关低温环境下的野外自然好氧堆肥研究报道较少。

好氧堆肥的实质是利用微生物的生长和代谢活动转化畜禽粪便中的有机物为无机物和稳定的腐殖质的过程［2］，微生物群落的代谢能力和菌群结构是影响好氧堆肥效果的关键因素［3］。堆肥过程中参与的微生物数量庞大，种类繁多，作用复杂，由于绝大部分微生物难以实现纯培养，因此，无法采用传统方法对其进行分离和鉴定。近年来，高通量测序技术被广泛应用于堆肥环境中微生物多样性分析，该技术可检测到样本中传统纯培养不能发现的低丰度微生物菌群，有助于更加全面准确地揭示环境中微生物群落的复杂度和多样性［4］。该研究选取猪粪和稻壳作为堆肥原料，在冬季低温条件下采用好氧堆肥工艺，研究野外堆肥过程中主要理化参数的动态变化，并对堆肥过程中微生物群落变化进行分析，从而深入了解低温环境下堆肥过程中微生物群落的变化规律，为开发适宜农村分散的小堆体畜禽粪便冬季自然好氧堆肥化利用提供依据，从而促进畜禽粪便的资源化利用。

1 材料与方法

1.1 材料来源

新鲜猪粪取自兴平市星光良种猪繁养殖有限公司，稻壳购自湖北京和米业有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 好氧堆肥试验设计。

试验在冬季进行，环境温度为-6.7～6.4 ℃，试验地点为陕西西安。

将稻壳粉碎，过12目筛，按一定比例与新鲜猪粪混合均匀，调节碳氮比为30左右，调节堆体含水量为60%左右，堆体为圆锥体。每3 d翻堆1次，进入降温阶段后，每7 d翻堆1次，进入腐熟期停止翻堆，整个堆肥周期为38 d。

1.2.2 采样方法。

从堆制0 d起，每2 d于堆体内部分别距离底部30 cm处和距离外部15～30 cm处的截面上多点共取混合样品500 g（鲜重），样品混匀后，采用四分法取样，样品分为两份，一份用于测定理化指标，另一份贮存于-20 ℃冰箱备用。同时，于堆肥的0、4、10、16、38 d分别取样，编号依次为1、2、3、4、5，贮存于-80 ℃冰箱用于高通量测序。

1.2.3 理化指标分析。

采用自动温度记录仪测定堆体温度，将温度记录仪探头插入堆体距离底部30 cm处和距离外部15～30 cm处的截面上随机排布5个点，取平均温度作为堆体实际温度。取适量样品于105 ℃下干燥至恒重，计算含水率。pH采用pH计测定。

硝态氮（NO-3-N）按NY/T 1116—2014规定的方法测定。

铵态氮（NH+4-N）采用靛酚蓝比色法测定［5］。

种子发芽指数：取新鲜堆肥样品3 g加入30 mL去离子水中，置于水平摇床上振荡2 h后过滤，吸取滤液5 mL，加到铺有滤纸的9 cm培养皿中。每个培养皿内点播20粒颗粒饱满的小白菜种子，置于培养箱中于28 ℃培养，避光培养3 d，以去离子水作对照，按下式计算发芽指数［6］：

GI=（A×B）/（C×D）×100%（1）

式中：A为堆肥浸提液种子发芽率；B为堆肥浸提液种子根长；C为蒸馏水种子发芽率；D为蒸馏水种子根长。

1.2.4 微生物群落结构分析。

1.2.4.1 DNA的提取。

样品DNA采用E.Z.N.ATM Mag-Bind Soil DNA Kit试剂盒（OMEGA，美国）按操作流程进行提取。

1.2.4.2 16S rDNA和ITS序列高通量测序。

采用特异性引物341F（CCTACGGGNGGCWGCAG）、805R（GACTACHVGGGTATCTAATCC）对细菌16S rDNA 基因的V3～V4可变区进行PCR扩增。采用特异性引物ITS1F（CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA）、ITS2R（GCTGCGTTCTTCATCGATGC）对真菌ITS rDNA基因的ITS1～ITS2区进行PCR扩增。PCR初次扩增条件：94 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s，45 ℃ 20 s，65 ℃ 30 s，5个循环；94 ℃ 20 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，20个循环；72 ℃ 5 min。PCR二次扩增条件：95 ℃ 3 min，94 ℃ 20 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，5个循环；72 ℃ 5 min。进一步对DNA进行纯化，利用Qubit3.0 DNA 检测试剂盒对回收的DNA 精确定量，等量混合后送生工生物工程（上海）股份有限公司基于Illumina平台进行高通量测序分析。