苹果汁发酵用乳酸菌WFC 414和WFC502的筛选·鉴定与评价

摘要  以泡菜为原料分离和筛选苹果汁中具有优良发酵潜力的乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）菌株，采用形态学、生理学和遗传学对LAB菌株进行鉴定，并评价其在模拟胃肠环境中的生存能力和发酵性能。结果表明：从泡菜中筛选的2株菌株为副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei WFC 414）和植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum WFC 502）；WFC 414和WFC 502在苹果汁中发酵48 h其活菌数分别达到8.81和9.33 log CFU/mL；2种菌株在模拟胃液（2 h）和肠液（4 h）中，其存活率分别达到92.0%、95.0%和80.7%、83.6%。在4 d的乳酸发酵过程中，WFC 414和WFC 502降低了苹果汁中可溶性糖和苹果酸的含量，产生了大量的乳酸（分别为3.48、5.94 mg/mL）。发酵苹果汁挥发性香气成分改变，酯类和醛类减少，醇类、酸类和酮类的含量升高，增加了果汁的甜香、果香、花香味。试验筛选的乳酸菌WFC 414和WFC 502在发酵果汁行业有很好的应用潜力。

关键词  乳酸菌；筛选；发酵；苹果汁；评价

中图分类号  TS201.3  文献标识码  A  文章编号  0517-6611（2024）09-0139-08

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.09.032

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Screening， Identification and Evaluation of Lactic Acid Bacteria WFC 414 and WFC 502 for Apple Juice Fermentation

YANG Qing-bo1， LIANG Jia-rui1， MENG Yong-hong1，2.3 et al

（1. College of Food Engineering and Nutritional Science， Shaanxi Normal University， Xi’an， Shaanxi 710062; 2. National Research ＆ Development Center of Apple Processing Technology， Xi’an， Shaanxi 710119; 3.Engineering Research Center of High Value Utilization of Western China Fruit Resources， Ministry of Education， Xi’an， Shaanxi 710119）

Abstract  The lactic acid bacteria with excellent fermentation potential were separated and screened for fermented apple juice using pickles as materials in this experiment. These strains were identified with the methods of morphology， physiology and genetics. The fermentation potential and survival ability in a simulated gastrointestinal environment of these strains were evaluated. The experimental results showed that two LAB strains with excellent fermentation potential were Lactobacillus paracasei WFC 414 and Lactobacillus plantarum WFC 502. The viable counts of WFC 414 and WFC 502 in fermented apple juice for 48 h reached 8.81 and 9.33 log CFU/mL respectively， while their survival rates reached 92%， 95%， and 80.7%， 83.6% respectively， in a 2 h simulated gastric fluid and 4 h simulated intestinal fluid. During lactic acid fermentation of 4 d， WFC 414 and WFC 502 reduced the content of soluble sugars and malic acid in apple juice and produced large amounts of lactic acid （3.48 and 5.94 mg/mL respectively）. There was alteration of volatile aroma components in fermentation apple juice， esters and aldehydes were reduced by both strains， while the content of alcohols， acids and ketones was elevated to increase the sweet， fruity， floral aroma of fermented apple fruit juice. These results suggest that WFC 414 and WFC 502 have great potential for application in the fermented juice industry.

Key words  Lactic acid bacteria;Screen;Fermentation;Apple juice;Evaluation

基金项目  国家自然科学基金面上项目（2017YFD0400700）。

作者简介  杨青博（1999—），女，陕西西安人，硕士研究生，研究方向：食品科学。*通信作者，教授，博士，从事苹果加工与生物发酵工程研究。

收稿日期  2023-06-25

微生物发酵是最常用的食品加工保存方法之一［1］，食物在有益微生物（如lactic acid bacteria，LAB）的作用下，含有的糖类、蛋白质、脂类等被分解转化为独特的风味和营养成分［2-3］，其中发酵乳制品酸奶和奶酪等一直广受世界各地消费者的欢迎。但随着人们对乳糖不耐受和高胆固醇危害的认识不断加深，以水果蔬菜等为基础的发酵果蔬汁类产品吸引了消费者和食品研究人员的更多关注［4］。目前乳酸菌（LAB）发酵在果蔬植物发酵中的应用广泛［4］，且LAB 广泛被认为是一种可在机体肠道内定殖的益生菌，被证明具有缓解肥胖，调节肠道菌群平衡，调控认知功能障碍等多种生物活性［5］，因此发酵已发展为一种精心设计的用于制造功能性食品的生物技术。

苹果含有多种生物活性物质，摄入可预防慢性病、癌症和心血管疾病［6］。鲜榨苹果汁（not form concentrate，NFC）最大程度保存了苹果的有效成分（但NFC 保鲜期很短），含有大量的碳水化合物、维生素等营养物质［7］，是 LAB 发酵的优良底物。LAB通过发酵果汁中的碳水化合物产生乳酸，可改善其风味和口感，提高果汁营养和质量，并延长果汁货架期［8-9］。同时，LAB 发酵的苹果汁也可改善巴氏杀菌、蒸煮等加工步骤造成的苹果汁（如浓缩果汁，form concentrate，FC）的不良变化 ［10-11］。但可应用于苹果汁发酵的 LAB 菌株十分有限，因此，筛选出更多适合苹果汁发酵并能在肠道中定殖的LAB菌株，以增加果汁用益生菌，及扩大发酵食品领域是亟待解决的问题。

泡菜是我国传统发酵食品，其主要由蔬菜上自然附着的微生物发酵而成，其菌种复杂多样，营养丰富，更适于食品的发酵［12］。研究也发现，与自然界中的微生物相比，从传统发酵食品中分离出的 LAB 能够使果汁产生更加令人满意的风味，可以对发酵过程进行标准和安全的控制，并稳定产品的质量［13-14］。

笔者以泡菜为原料分离LAB，筛选出在发酵苹果汁时具有高活性和产香能力强的LAB菌株，对其进行生理生化和基因鉴定，并通过对菌株生长活力，在模拟胃肠道环境中的存活率，苹果汁有机酸和可溶性糖含量以及挥发性香气化合物等指标进行分析，评价所选定的菌株发酵苹果汁的性能优劣，为发酵苹果汁专用菌株的规模化生产提供试验依据，进一步为丰富新型发酵果汁领域产品种类及开发健康营养的商业化苹果汁的益生菌类产品提供基础数据。

1  材料与方法

1.1  材料与设备

4种泡菜：购自华润万家超市（品牌为甘肃陇浆源、四川鲜箩、沈阳榆园、沈阳比美味）；红富士苹果：采自陕西省长武县苹果园。试剂：抗坏血酸、甘油、KH2PO4、 H3PO4、 NaCl、乳酸、丙酮酸、柠檬酸、酒石酸、草酸等，购自天津天利公司；3-辛醇、果糖、 葡萄糖、蔗糖、苹果酸等购自阿拉丁；乙腈、甲醇等购自科密欧。生化鉴定管：青岛海博生物公司。MRS 固体培养基、MRS 肉汤：购自北京奥博星公司。试验设备：榨汁机，惠人设备公司；恒温培养箱，培英实验设备有限公司；高速台式离心机，赛默飞仪器公司；高效液相色谱，安捷伦；恒温水浴锅，杜甫仪器厂；气相色谱串联质谱检测器，日本岛津公司。

1.2  试验方法

1.2.1  泡菜中菌株的分离与保存。

分别吸取4种泡菜汁各0.1 mL，稀释后接种于MRS固体培养基上，在37 ℃条件下厌氧培养48 h。挑取不同泡菜固体培养基上的单个菌落各20个，再进行2次划线纯化培养，纯化后的菌株在MRS肉汤中于37 ℃培养24 h得到菌悬液，并置于50%甘油中保存在-80 ℃冰箱中。

1.2.2  新鲜苹果汁的准备和发酵。

挑选新鲜无病虫害的红富士苹果，将苹果削皮，去核，切成小块，并立即在0.5%抗坏血酸溶液中浸泡15 s，后使用榨汁机榨取苹果汁，将分离掉果渣的果汁再用滤布过滤得到苹果清汁，然后将鲜榨苹果汁进行巴氏杀菌（果汁加热至90 ℃并保持微沸20 s），最后趁热将果汁灌装入已灭菌的玻璃瓶中，加盖后倒扣放置，待其自然冷却至室温即可得到巴氏杀菌的苹果汁［10］（pasteurized apple juice，PAJ）。

将“1.2.1”中活化后的菌悬液以 6 000 r/min于4 ℃离心5 min，去上清，并用生理盐水洗涤菌体2次后等体积重悬。再以 1%（v/v）的接种量接种到巴PAJ中，使发酵前的果汁中活菌数约为6 log CFU/mL，在37 ℃下厌氧发酵48 h，可得到发酵苹果汁（fermented apple juice，FAJ）［9，14］。

1.2.3  菌株的筛选。

初筛采用感官鉴评法对FAJ进行嗅闻，去除发酵后香气不明显和产生明显不愉快气味的菌株进行［15］。然后用无菌生理盐水的标准连续稀释法对苹果汁发酵前后的活细胞进行计数。将稀释后的FAJ样品接种在MRS琼脂平板上，在37 ℃培养箱中倒置培养48 h。挑选出发酵过程中活细胞数增加最多和最快的菌株。同时，将FAJ稀释后涂在补充有0.7% CaCO3的MRS琼脂平板上，在37 ℃下倒置培养48 h，观察是否形成溶钙圈（有溶钙圈的菌株被认为有可能是LAB）。20名经过培训的志愿者（10名男性和10名女性）对FAJ的气味感官特性进行嗅闻评估（香气分为果香、甜香、草香、花香和刺鼻），采用9分制（0=无，9=特别强）进行打分，并绘制蜘蛛网图。