不同蔬菜种植对虾菜共生系统中微生物群落结构的影响

摘要 ［目的］研究蕹菜、甘薯、枸杞对虾菜共生系统中微生物群落结构的影响。［方法］通过高通量测序技术分析种植不同蔬菜的虾菜共生系统中微生物群落组成，并检测该系统中的硝酸盐、磷酸盐指标。［结果］不同虾菜共生系统中水体微生物共同的OTU数目为450种，其中，枸杞组（LM）的OTU数目最多，为852种，且Shannon-Wiener指数和Simpson指数最高；蕹菜组（IF）对硝酸盐、磷酸盐去除率分别达65.70%和67.57%，且与其他组群落结构差异显著（P<0.05）。在门水平上，不同系统中水体的优势菌群为变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、Patescibacteria；在属水平上，不同系统中的优势菌群为红球菌属（Rhodococcus）、不动杆菌属（Acinetobacter）、谷氨酸杆菌属（Glutamicibacter）。［结论］甘薯和枸杞更有利于维持水环境的稳定，蕹菜对硝酸盐、磷酸盐去除效果更好。

关键词 虾菜共生；蔬菜种植；微生物；群落结构；高通量测序

中图分类号 S182；S917.1  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2024）10-0103-06

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.10.022

Effects of Different Vegetable Cultivation on the Microbial Community Structure in Shrimp-vegetable Symbiotic System

REN Si-qi1，2，YING Zhao-han1，WU Xin-rui1 et al

（1. College of Bioscience， Zhejiang Normal University， Jinhua，Zhejiang 321004;2. Key Laboratory of Wildlife Biotechnology and Conservation and Utilization of Zhejiang Province， Jinhua，Zhejiang 321004）

Abstract ［Objective］ To study the effects of Ipomoea aquatica， Ipomoea batatas and Lycium chinense on the microbial community structure in shrimp-vegetable symbiotic system.［Method］The composition of microbial community in shrimp-vegetable symbiotic system growing different vegetables was analyzed by high-throughput sequencing technique， and the indexes of nitrate and phosphate in the system were detected. ［Result］The number of OTU shared by microorganisms in different shrimp-vegetable symbiotic systems was 450 species，among them， the number of OTU in Lycium chinense group （LM） was the highest （852 species）， and the Shannon-Wiener index and Simpson index were the highest. The removal rates of nitrate and phosphate in Ipomoea aquatica （IF） were 65.70% and 67.57%， respectively， and the community structure was significantly different from other groups （P<0.05）. At the gate level， the dominant flora in different systems were Proteobacteria， Actinobacteria and Patescibacteria.At the genus level，while the dominant flora in different systems were Rhodococcus， Acinetobacter and Glutamicibacter. ［Conclusion］Ipomoea batatas and Lycium chinense were more beneficial to maintain the stability of water environment， and Ipomoea aquatica was more effective in removing nitrate and phosphate.

Key words Shrimp-vegetable symbiosis;Vegetable cultivation;Microorganism;Community structure;High-throughput sequencing

基金项目 金华市重点研发项目（2021-2-017）；浙江省重点研发项目（2020C02014）。

作者简介 任思齐（1998—），男，浙江杭州人，硕士研究生，研究方向：水生动物生态学。

*通信作者，教授，硕士，硕士生导师，从事水生生物学研究。

收稿日期 2023-08-01；修回日期 2023-08-24

虾菜共生系统是基于鱼菜共生系统的一种新发展，利用养殖系统中的对虾排泄物（包括颗粒废物固体和溶解的营养物质）作为营养介质，种植可食用蔬菜［1］，系统中的微生物群落可降解对虾排泄物，有助于植物吸收，并降低水体中的氨氮、亚硝酸盐、硝酸盐和磷酸盐等含氮、高磷营养盐，从而改善养殖水质，使对虾养殖系统处于稳定状态。因此，虾菜共生系统在水资源循环利用、养殖废弃物高效处理等方面具有明显的优势［2-3］。总体来说，与传统农业相比，虾菜共生系统很好地利用虾-菜-菌之间的互作关系，减少了碳排放和水污染。近年来随着分子生物学的发展，尤其是高通量测序技术的研发及应用，使该技术能够较准确地定性和定量分析微生物的多样性和丰度，有利于精准了解虾菜共生模式下的微生物群落结构［4-9］。

凡纳滨对虾（Penaeus vanmamei）是一种生长快、适应性强的养殖品种，总体上认为5‰以上的盐度对虾的生长和成活率相对较好。在生产实践表明，蕹菜（Ipomoea aquatica Forssk.）、甘薯［Ipomoea batatas（L.）Lam.］和枸杞（Lycium chinense Mill.）3种植物都可在虾菜共生系统中具有较好的生长优势。研究表明，室内对虾循环水养殖对养殖水体水质具有良好的调节效果，可有效控制养殖水体 COD、NH+4-N和NO-2-N浓度，具有较强的可行性［3，10-12］，且在鱼菜共生模式下，蕹菜对水体氮磷处理及微生物群落变化的研究颇多，该模式对保持根际微生物在提高蔬菜对环境胁迫的抗逆性上有重要作用，能有效促进植物的生长［13-15］。甘薯和枸杞也是常见的经济作物且这2种作物具有较高的药用价值［16］。但现有研究都缺乏不同植物对虾菜共生系统中水体微生物多样性的相关研究。因此，该研究在以凡纳滨对虾为养殖对象的虾菜共生系统中，探究栽培蕹菜、甘薯、枸杞3种植物对水体微生物多样性的影响，以期为虾菜共生系统微生物的作用机制提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 试验设计

基于虾菜共生系统设计试验装置，装置包括养殖缸和种植槽两部分。养殖缸长30.0 cm、宽21.0 cm、高24.5 cm，养殖缸上方嵌套种植槽，种植槽长30 cm、宽21 cm、高12 cm。种植槽进水管口接10 cm长的200目发酵过滤袋，用于破碎颗粒有机物。种植槽填埋10 cm厚的陶粒和火山石，蔬菜种植在陶粒上。水泵抽取养殖水经发酵过滤袋过滤后，水溶性有机物经陶粒生物降解，产生的营养盐被蔬菜吸收后，经溢流口流回养殖区。

试验周期21 d，试验所选蔬菜蕹菜、甘薯、枸杞均为人工栽培的幼苗，根系生长健全。分别选取植株大小相似的菜苗进行试验，试验分别为蕹菜组（IF）、甘薯组（IL）和枸杞组（LM）。每个种植槽栽植12株，设置3个平行组。并同时设置空白组（CK）。试验缸放置5.5 L养殖水，养殖水取自虾菜共生养殖基地（水体盐度为5‰、pH 8.17、硝酸盐0.37 mg/L、磷酸盐5.35 mg/L、氨氮0.12 mg/L、亚硝酸盐0.06 mg/L）。由于对虾在生长过程中会吸收离子元素和排出代谢废物等，因此，为排除对虾这一因素对系统的干扰，该系统采用蔬菜养殖区和水循环区进行试验。

1.2 样品采集

用孔径0.22 μm的醋酸纤维素滤膜（Merk Millipore，USA）对试验前后的水样进行真空抽滤，滤膜装入灭菌后的离心管，液氮速冻，置于-80 ℃超低温冰箱保存。利用 Ezup柱式细菌基因组 DNA 提取试剂盒采取水样DNA（上海生工生物工程股份有限公司），对提取后的 DNA 经琼脂糖凝胶电泳检测其质量和完整性后，进行提取基因组DNA，用带有barcode的特异引物扩增16S rDNA的V3～V4区。

1.3 Illumina Miseq测序

引物序列为341F（CCTACGGGN-GGCWGCAG-3′）和806R（GGACTACHVGGGTATCTAAT-5′）。 将纯化后的扩增产物连接测序接头并构建测序文库，最后送至广州基迪奥生物科技有限公司进行Illumina上机测序。

1.4 数据分析

将测序获得的raw reads进行低质量reads过滤（FASTP软件），并进行Tags拼接（FLASH软件）、Tags过滤、OTU聚类（USEARCH软件的UPARSE算法）和Tags去嵌合体（USEARCH软件的UCHIME算法）；使用Qiime软件进行Alpha多样性分析；以相关系数绝对值>0.5且P<0.05为阈值，筛选展示满足条件的结果，绘制物种丰度柱状图；使用R语言vegan包进行维恩图分析；使用R语言GUniFrac包，基于OTU序列进化树和OTU丰度表，计算weighted unifrac距离指数；使用 FAPROTAX（functional annotation of prokaryotic taxa）软件，结合 SILVA的物种注释并整合原核功能数据库，构建 “物种-生态功能分类”的关系网络。

2 结果与分析

2.1 样品测序质量及复杂度分析

该试验共得到12个样品（对照组CK-3在收集样品时被污染，以11个样本进行展开分析）。从11个样品中得到的平均原始序列为112 854条，构建OTU分类信息单元且获得注释信息的平均Tags数为83 782条，有效率达到74.24%。测序样品检测到OTU平均数（相似度大于97%）为765种（表1）。

稀释曲线可直接反映测序数据量的完整性，并间接反映样品中物种的丰富程度。对样品进行多次随机抽样，构建稀释曲线如图1a所示，在随机抽取的测序数量大于40 000种时，曲线趋于平缓，表明测序数量渐进合理。当测序数量≥60 000种时，微生物群落OTU数目表现为LM>CK>IL>IF。样品相对丰度稀释曲线（图1b）直观地反映了样品中物种的丰富度和均匀度。LM组在水平方向上的跨度较大，表明枸杞组水体微生物的丰富度较高；而CK组在垂直方向上曲线的跨度较小，表明其水体微生物的均匀程度相对较低。