根瘤菌对茎瘤芥的促生作用研究

摘要 ［目的］研究田菁茎瘤固氮根瘤菌侵染茎瘤芥的情况以及对植株促生作用的影响。［方法］分析根瘤菌对不同品种茎瘤芥的促生作用差异、不同浓度根瘤菌对茎瘤芥栽培品种“涪杂2号”的影响、不同诱导剂对结瘤的影响。［结果］田菁茎瘤固氮根瘤菌侵染的6个茎瘤芥品种中，“涪杂2号”根长和株高增加显著，促生作用明显。以不同浓度田菁茎瘤固氮根瘤菌侵染“涪杂2号”幼苗结果表明，在1.0×108个/mL浓度下，茎瘤芥的根长和株高增加最为显著，同时利用荧光显微镜观察到根瘤菌在“涪杂2号”健康幼苗根部组织的定殖情况，在处理茎瘤芥3 d后，根瘤菌可侵入茎瘤芥根部并定殖，在接菌15 d后，在茎瘤芥根系局部组织发展成很高的群体密度。横向比较3种诱导剂诱导茎瘤芥结瘤效率差异表明，使用2，4-D、氯磺隆、豆科威后，3种诱导剂均可在30 d后于茎瘤芥根部形成类根瘤，60 d后类根瘤数量明显增多，其中，2，4-D结瘤效率最好，高达93%，显著高于其他2种诱导剂结瘤效率。［结论］该研究为更好地利用根瘤菌促进茎瘤芥生长的共生体系打下基础。

关键词 茎瘤芥；田菁茎瘤固氮根瘤菌；诱导结瘤；促生作用

中图分类号 S-3   文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2024）12-0001-06

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.12.001

Study on the Growth-promoting Effect of Rhizobia on Tumorous Stem Mustard

MAO Zhong-yu1，CHANG Li-jie2，WANG Dian-dong2

（1.College of Biology and Food Enginerring，Chongqing Three Gorges University，Chongqing 404100；2.School of Advanced Agriculture and Bioengineering，Yangtze Normal University，Chongqing 408000）

Abstract ［Objective］To study the infection of Azorhizobium caulinodans in tumorous stem mustard and its effect on plant growth promotion.［Method］The differences in growth promoting effects of rhizobia on different varieties of tumorous stem mustard，the effects of different concentrations of rhizobia on the cultivated variety ‘Fuza 2’ of tumorous stem mustard and the effects of different inducers on nodulation were analyzed.［Result］The root length and plant height of ‘Fulza 2’ increased significantly，and the growth promotion effect was obvious among the 6 stem mustard varieties infected with nitrogen-fixing rhizobia.The results of different concentrations of Azorhizobium caulinodans showed that the root length and plant height of ‘Fulza 2’ seedlings increased significantly at the concentration of 1.0×108 rhizobium/mL，and the colonization of rhizobium in the root tissues of healthy ‘Fulza 2’ seedlings was observed by fluorescence microscopy.After 3 days of treatment，rhizobium could invade and colonize the roots of ‘Fulza 2’ seedlings.After 15 days of inoculation，high population density was developed in the local tissues of stems.Horizontal comparison of the three inducers’ nodulation efficiency showed that the three inducers could form nodule in the roots of stem tumor mustard after 30 days，and the number of nodule increased significantly after 60 days.The nodulation efficiency of 2，4-D was the best，up to 93%，which was significantly higher than that of the other two inducers.［Conclusion］ This study lays the foundation for better utilizing the symbiotic system of rhizobia to promote the growth of stem mustard.

Key words Tumorous stem mustard;Azorhizobium caulinodans；Induction nodulation;Growth-promoting effect

基金项目 重庆市高校创新研究群体项目（CXQT21029）。

作者简介 毛仲玉（1997—），女，黑龙江大兴安岭人，硕士研究生，研究方向：作物病害防治。*通信作者，教授，博士，硕士生导师，从事主要土传病害、植物寄生线虫等发病规律和致病机理研究。

收稿日期 2023-08-09

茎瘤芥（Brassica juncea var.tumida）是重庆地区主栽的经济作物之一，其茎部发生膨大，是制作榨菜的主要原料，具有很高的经济价值［1］。现代营养学认为，榨菜能健脾开胃、补气添精、增食助神，榨菜与法国酸黄瓜、德国甜酸甘蓝并称为世界三大名腌菜［2］。

根瘤菌（Rhizobium）属于革兰氏阴性杆菌，可侵入豆科植物体内并在根部形成根瘤［3］。田菁茎瘤固氮根瘤菌（Azorhizobium caulinodans）是根瘤菌一个新属——固氮根瘤菌属［4］，从豆科植物田菁中分离，与其他根瘤菌属的不同点是根瘤菌可以完成自生固氮。田菁茎瘤固氮根瘤菌可以把分子态氮转化成为植物可吸收利用的氨态氮形式，对植物生长具有促生作用，同时还可提高植物抵抗不利环境及病原菌的免疫能力，从而达到增加作物产量的目的［5-6］。近年来，人们通过基因标记等检测手段跟踪根瘤菌在非豆科植物根圈的定殖动态［7］，发现许多根瘤菌在非豆科植物（水稻、油菜、小麦和棉花等）的根圈具有较强的定殖能力，并对植物根系以及地上部分的生长有很好的促进作用［8］。

诱导剂也是植物生长激素，与激素相对应物质结合可完成对植物生长的调节作用。可以与植物激素完成结合引起细胞发生生理生化变化的蛋白质定义为激素受体［9］。激素受体位点的分布较广，如细胞质、细胞核、细胞质膜［10］。植物自身具有激素种类较多，故有较多种类激素受体分布在细胞不同位置。诱导剂作用于各位点受到激素影响，会引起膜结构和功能发生改变，使一些依附在位点的酶和酶原失活或活化。酶系统发生改变会引起整个细胞的生理生长和新陈代谢功能也在一定程度上发生改变［11］。

基于根肿病、根瘤和根结线虫在植物根系寄生位点相同，引起根部形成瘤状相似。该研究根据根瘤菌对植物生长具有一定促生作用的特点，优化根瘤菌侵染茎瘤芥体系，引根瘤菌侵入茎瘤芥根部并定殖，研究根瘤菌对茎瘤芥的促生作用，为更好地利用根瘤菌促进茎瘤芥生长的共生体系打下基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料 试验于2019年9月至2022年5月在重庆市涪陵区长江师范学院现代农业与生物工程学院病虫害防治实验室中进行。供试田菁茎瘤固氮根瘤菌Azorhizobium caulinodans ORS 571，由湖南农业科学院植物保护研究所提供；茎瘤芥品种“涪杂2号”“永安小叶”“永安传奇”“高山青”“早青2号”“成都郫县榨菜”由长江师范学院刘义华老师馈赠和重庆市涪陵区农贸市场购买；诱导剂选用2，4-D、豆科威、氯黄隆。

1.2 试验方法

1.2.1 根瘤菌对不同品种茎瘤芥侵染。

选取6个茎瘤芥品种种子，分别放置2 mL已灭菌的离心管中，用50%次氯酸钠浸泡种子10 min，期间振荡离心管确保所有种子浸泡，倒出清洗液后使用移液枪吸取无菌水冲洗5次，进行表面消毒后放置在装有灭菌琼脂组培瓶中，每个品种每瓶10粒，设5个重复［12］，种子萌发2 d后幼苗用于根瘤菌接种试验。挑选生长状态大致相同的幼苗，吸取OD600在0.6～0.8的菌液并稀释至1.0×108个/mL菌液加至琼脂培养基上。对照组接等量PBS缓冲液，设5个重复。培养条件同上，接菌培养后9 d后调查茎瘤芥生长情况。无菌水冲洗，自然风干后放置黑色桌面拍照，测量其根长和株高，取代表性幼苗制片用于荧光显微镜观察。

1.2.2 不同浓度根瘤菌对茎瘤芥侵染。

将已消毒的“涪杂2号”种子置于琼脂-水固体培养基上限菌培养，待种子萌发至两叶一心期时，镊子剔除未萌发的种子，留有生长状态大致相同的幼苗。将对数生长期的根瘤菌菌液放置50 mL离心管中，4 500 r/min离心10 min收集菌体，用PBS缓冲液分别稀释为1.0×109、1.0×108、1.0×107、1.0×106  个/mL 4个不同浓度备用。分别吸取不同浓度1 mL根瘤菌菌液至培养基表面，每个浓度设4个重复，每瓶10粒，平行对照接等量PBS，设4个重复［4］。接菌培养9 d后，调查茎瘤芥幼苗生长情况并用直尺测量根长和株高。

1.2.3 根瘤菌在茎瘤芥根系定殖情况观察。

室内条件下，选用“涪杂2号”饱满种子表面消毒，消毒方式同“1.2.1”。置于琼脂-水固体培养基上限菌培养，萌发至两叶一心期，每个组培瓶吸取1 mL 1.0×108个/mL PBS稀释菌液加至琼脂-水固体培养基表面，使茎瘤芥幼苗接菌。接菌后，封口膜密封组培瓶以免污染，放置常规智能培养架限菌培养［13］。设置接菌3、6、9、12、15、18、21 d 等时间梯度，定期用荧光显微镜检测茎瘤芥幼苗根部被绿色荧光蛋白（GFP）标记根瘤菌定殖情况。

1.2.4 不同浓度根瘤菌结瘤诱导剂对茎瘤芥根系结瘤的影响。

将2，4-D、氯黄隆和豆科威3种诱导剂浓度梯度依次稀释为0.5、1.0、2.5 mg/L，同时将对数生长期的根瘤菌用PBS缓冲液稀释浓度至1.0×108个/mL备用。表面消毒的茎瘤芥“涪杂2号”种子放置滤纸上催芽，封口膜贴封培养皿进行限菌培养。3种诱导剂的每个处理10粒，设5个重复，萌发至两叶一心期，每个处理加入不同浓度诱导剂后再同时加入等量的1 mL 的1.0×108个/mL根瘤菌菌液，于24 ℃温室培养。30 d后观察根部结瘤情况和测量各处理下茎瘤芥的根长、株高、叶长、根重和叶重，分析不同诱导剂与根瘤菌组合使用对茎瘤芥生理指标的影响。