虾类十足目虹彩病毒1（DIV1）LAMP-HNB快检方法的建立

摘要 ［目的］建立一种操作简便、快速、可视化的虾类病原检测方法，实现基层养殖户自检。［方法］针对十足目虹彩病毒1（DIV1），设计环介导等温扩增（LAMP）特异性引物，对反应试剂用量、温度、反应时间等条件进行优化，建立LAMP与羟基萘酚蓝（HNB）结合的LAMP-HNB可视化快速检测方法。［结果］在LAMP反应体系中添加12 mmol/L Mg2+和250 μmol/L HNB，65 ℃恒温条件下反应60 min最佳；DIV1病原质粒最低检出限为102 copies/μL，稳定性和特异性较好，通过带有靶标基因的阳性质粒进行16次重复性试验结果均较为稳定，多种模板扩增试验均未发生假阳性情况，符合试验要求。［结论］该研究建立的LAMP-HNB可视化快速检测方法，适用于上述对虾DIV1的现场快速检测。

关键词 南美白对虾；LAMP；HNB；十足目虹彩病毒1；快速检测

中图分类号 S945.4  文献标识码 A   文章编号 0517-6611（2024）15-0192-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.15.041

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Establishment of LAMP-HNB Rapid Detection Method for Decapod Iridescent Virus 1 （DIV1） of Shrimp

WANG Wen-qiong1，GE Ming-feng1，LU Xian-dong2 et al

（1.Ningbo Ocean and Fisheries Research Institute，Ningbo，Zhejiang 315012;2.Ningbo AiGene Technology Co.，Ltd.，Ningbo，Zhejiang 315105）

Abstract ［Objective］To establish a simple，rapid and visual pathogen detection method for shrimp，and to achieve self detection by fishermen.［Method］The specific primers of LAMP （loop-mediated isothermal amplification technique） were designed for decapod iridescent virus 1 （DIV1）.After optimizing the conditions of reagent dosage，temperature and reaction time，a visual and rapid detection method of LAMP combined with hydroxynaphthol blue （HNB） was established.［Result］12 mmol/L Mg2+ and 250 μmol/L HNB solution in the LAMP reaction system was the most suitable condition at 65 ℃ for 60 min.The minimum detection limits of LAMP-HNB of  DIV1 was 102 copies/μL plasmid.The stability and specificity of the detection of DIV1 had also been verified using positive plasmids with target genes，and the results of 16 repeated experiments were relatively stable，multiple template amplification experiments did not show false positives，which meets the experimental requirements.［Conclusion］The LAMP-HNB visualization rapid detection method established in this study is suitable for the on-site rapid detection of shrimp DIV1 mentioned above.

Key words Litopenaeus vannamei;LAMP;HNB;Decapod iridescent virus 1（DIV1）;Rapid detection

我国是虾类养殖大国，特别是南美白对虾（Litopenaeus vannamei），为我国主导养殖虾类品种。随着高密度、集约化水产养殖模式的普及，各类疾病频发。据《2022中国水生动物卫生状况报告》，2021年养殖虾类因疾病造成的经济损失高达90亿元，而十足目虹彩病毒1（DIV1）为感染养殖虾类的主要病原［1］。因此，急需建立一种针对虾类疾病的快速诊断技术，以便基层养殖企业第一时间发现病原，从而采取防控措施及时止损。目前国内外已有多种方法用于对虾病原检测，如聚合酶链式反应（PCR）、微阵列检测、核酸分子杂交等［2］，但这些方法存在操作步骤烦琐、操作时间长、对仪器和操作要求较高、易导致气溶胶污染等不足，不适合基层快速检测。

环介导等温扩增（LAMP）技术是一项新型核酸扩增技术，具有特异性强、灵敏度和重复性良好、结果判读简易、不需要特殊设备、操作简单等优点［3］。羟基萘酚蓝（HNB）在LAMP反应体系中作为产物指示剂，既能满足肉眼判读结果的需求，又能避免反应后开盖引起的气溶胶污染，更适合在实际检测中应用［4］。LAMP-HNB是基于LAMP技术形成的一种可视化的快速检测方法，可通过反应前后染料的颜色变化来判断检测结果。此方法无需昂贵的热循环设备，具有成本低、特异性强、操作简单、高效快捷、结果易观察、满足基层现场操作等优点。该研究基于LAMP-HNB建立针对虾类十足目虹彩病毒1的快速检测方法，可使虾类养殖企业在养殖现场进行快速检测，该方法为及时排除对虾养殖期的病原感染风险、规避主要流行性病害暴发风险、提前做好预警和防治工作提供了技术支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

10×反应缓冲液和Bst DNA聚合酶，购自翌圣生物科技（上海）股份有限公司；SYBR Green荧光染料，购自生工生物工程（上海）股份有限公司；质粒，购自上海百力格生物技术有限公司。南美白对虾样品于2022年4—6月采集自浙江省宁波市各对虾养殖场，体长3～10 cm，现场取肝胰腺、鳃、肠、肌肉等组织经95%乙醇固定后带回实验室备用。

1.2 试验方法

1.2.1 LAMP引物设计。利用Primer Explorer V5软件，依据GenBank报道的病原特异性序列（GenBank序列号KY681040.1），分别设计两对LAMP引物，包括2条内引物（FIP：5′-ACGAATCGTTTCCCGTGAGA-CAAATGCTGACGA-AATCATCA-3′；BIP：5′-TGGGCTCGAGATTTGTTCCAAC-GCTTGTTGCAAATCATGTGTA-3′）和2条外引物（F3：5′-TGTTAGATGGGCAGTCATG-3′；B3：5′-GCATCCTTGATTGCTGGA-3′）。

1.2.2 最适反应温度优化。根据Bst DNA聚合酶特性，分别在63、65、67 ℃ 3个温度梯度下进行试验，通过比较荧光起峰时间确认最适反应温度。反应时间设定为60 min，模板为含DIV1靶基因序列的质粒（模板浓度为104 copies/μL），反应体系如下：含80 mmol/L MgSO4的10×反应缓冲液2.5 μL，10 mmol/L dNTP 4.0 μL，100 μmol/L F3/B3和FIP/BIP各1.0 μL，Bst DNA聚合酶大片段1.0 μL，SYBR Green 荧光染料0.5 μL，ddH2O 14.0 μL，模板1.0 μL，总体积25.0 μL。

1.2.3 最适反应时间优化。以DIV1靶基因质粒（浓度100～106 copies/μL）为模板，分别反应30、45、60 min后，观察荧光起峰时间，确认最适反应时间，反应体系同“1.2.2”。

1.2.4 Mg2+浓度优化。以DIV1靶基因质粒（浓度104 copies/μL）为模板，分别设置MgSO4终浓度为8、12、16 mmol/L，在3组试验中分别加入100 mmol/L MgSO4 0、1.0和2.0 μL，每组反应体系中再加含80 mmol/L MgSO4的10×反应缓冲液2.5 μL、10 mmol/L dNTP 4.0 μL、100 μmol/L F3/B3和FIP/BIP各1.0 μL、Bst DNA聚合酶大片段1.0 μL、SYBR Green荧光染料0.5 μL、HNB 1.0 μL，最终加ddH2O至25.0 μL，在65 ℃下反应60 min，确认最佳显色的同时，观察荧光起峰时间，确认最佳Mg2+浓度。

1.2.5 HNB浓度优化。对HNB浓度进行优化，以求获得最好的显色效果。以DIV1靶基因质粒（浓度104 copies/μL）为模板，设置HNB终浓度为150～500 μmol/L，在65 ℃下反应60 min，确认最佳显色浓度。反应体系如下：含80 mmol/L MgSO4的10×反应缓冲液2.5 μL，100 mmol/L MgSO4 1.0 μL，10 mmol/L dNTP 4.0 μL，100 μmol/L F3/B3和FIP/BIP各1.0 μL，Bst DNA聚合酶大片段1.0 μL，150～500 μmol/L HNB 1.0 μL，ddH2O 12.5 μL，模板1.0 μL，总体积25.0 μL。

1.2.6 特异性试验。以虾类常见的8种病原［白斑综合征病毒（WSSV）、传染性皮下及造血组织坏死病毒（IHHNV）、桃拉病毒（TSV）、传染性肌坏死病毒（IMNV）、对虾偷死野田村病毒（CMNV）、虾肝肠胞虫（EHP）、致急性肝胰腺坏死病弧菌（Vp

AHPND）、DIV1］以及ddH2O为模板进行特异性试验，观察DIV1检测体系是否产生非特异性扩增。反应条件（65 ℃下反应60 min）和反应体系见“1.2.5”，其中HNB终浓度为250 μmol/L。

1.2.7 灵敏度试验。通过调节DIV1的初始浓度，经10倍梯度稀释，制备质粒浓度为100～106 copies/μL，评估反应体系的灵敏度。通过观察HNB显色效果，探究检测体系的最低检测限，反应条件（65 ℃下反应60 min）和反应体系见“1.2.5”。

1.2.8 稳定性试验。为确保LAMP-HNB反应体系的稳定性，通过带有靶标基因的阳性质粒，进行16次重复试验，确认其稳定性。质粒浓度为DIV1检测限浓度，反应条件（65 ℃下反应60 min）和反应体系见“1.2.5”。

2 结果与分析

2.1 最适反应温度 从表1和图1可以看出，随温度上升，扩增效率随之提高，当温度升至67 ℃时扩增效率有所下降，故选择65 ℃作为最适反应温度。

2.2 最适反应时间

不同浓度的DIV1靶基因质粒模板对比试验（表2）发现，扩增曲线的起峰时间均在60 min内。从扩增曲线（图2）来看，起峰时间晚（模板浓度低）的扩增曲线在60 min以后才开始进入平台期（但这时已能确保结果的判定）。考虑到检测的快捷性和准确性要求，选择60 min较为合理。

2.3 最适Mg2+浓度筛选

不同Mg2+终浓度（8、12、16 mmol/L）对比试验（表3、图3）发现，12 mmol/L Mg2+组扩增效率最高，其次是16 mmol/L Mg2+组，而8 mmol/L Mg2+组的扩增效率最低。通过观察反应前后的颜色变化，其中8 mmol/L Mg2+组的颜色变化差距较小，不易观察，而16 mmol/L Mg2+组是从紫色变为紫罗兰色，只有12 mmol/L Mg2+组为紫罗兰色变为天蓝色，变化较为明显。因此在该试验中，12 mmol/L为反应体系最适Mg2+终浓度。