甘薯脱毒及种薯（苗）繁育技术研究

摘要 中国是世界上最大的甘薯生产国，然而由于病毒病的存在，严重制约了甘薯产业的发展，建立通用的脱毒组培体系、高灵敏度的检测体系及高效的种薯（苗）繁育体系对甘薯产业发展具有重要意义。对12个主栽品种进行茎尖脱毒处理，建立了通用的脱毒组培体系MS+2 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA，大多数品种的再生率在58%以上；获得SPFMV、SPCSV、SPLV、SPCFV和SPVG这5种病毒的特异性引物，该引物对病毒检测极限依次为10^-6、10^-1、10^-4、10^-3和10^-3，具有较高的灵敏性；对脱毒品系进行筛选，获得优良脱毒株系甘12和粉薯2-2；建立脱毒种薯（苗）的三级繁育体系，即组培苗（一级）扩繁，温网室基质苗（二级）扦插扩繁和网棚大田苗（三级）繁育生产用种；进行洗苗速率（带根和不带根）对比试验，移栽方式（带根和不带根）与每孔移栽棵数（1～3棵）的双因素试验，结果表明不带根处理可显著提升洗苗速率，育苗前期每孔移栽棵数（1～3棵）在株高、茎粗、节间数方面无显著差异，带根处理前期生长具有优势，但二者成活率无显著差异，并不影响育苗结果。因此，该研究有利于甘薯病毒病防治、脱毒种薯（苗）推广和育苗成本的降低。

关键词 甘薯；茎尖脱毒；病毒检测；脱毒繁育体系；组培苗移栽方式

中图分类号 S 531 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2024）16-0033-07

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.16.007

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Study on Virus-free and Seedling Propagation Techniques of Sweet Potato

QU Yu-yang¹，LIU Xun-long¹，YAO Feng² et al

（1. College of Horticulture and Forestry Sciences， Huazhong Agricultural University Key Laboratory of Potato Biology and Biotechnology， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Wuhan， Hubei 430000;2. Hongan County Ruifeng Breeding Specialized Cooperative， Huanggang， Hubei 438000）

Abstract China is the largest sweet potato producer in the world. However， the development of the sweet potato industry is severely constrained by viral diseases. The establishment of a universal virus-free tissue culture system， a highly sensitive detection system， and an efficient seed potato （seedling） breeding system are of great significance for the development of the sweet potato industry. A total of 12 main cultivars were subjected to shoot-tip virus elimination treatment using a universal tissue culture system MS+2 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA， with regeneration rates of over 58% for most cultivars. Specific primers for five viruses， namely SPFMV， SPCSV， SPLV， SPCFV and SPVG， were obtained. The detection limits of these primers for the viruses were 10^-6， 10^-1， 10^-4， 10^-3 and 10^-3， respectively， indicating high sensitivity. Virus-free lines were selected， and excellent virus-free strains Gan 12 and Fenshu 2-2 were obtained. A three-tier breeding system for virus-free seed potatoes was established， including tissue culture seedlings （first tier）， temperature-controlled greenhouse substrate seedlings （second tier） and field seedlings （third tier） for seed production. In addition， a comparison trial was conducted to evaluate the washing rate of seedlings （with roots and without roots）， as well as a dual-factor experiment to assess transplanting methods （with roots and without roots） and the number of transplanted seedlings per hole （1-3 plants）. Results showed that the treatment without roots significantly increased the washing rate of seedlings. There were no significant differences in plant height， stem thickness， and internode number among groups with different numbers of transplanted seedlings （1-3 plants） during the early stage of seedling growth. The treatment with roots had advantages in early growth， but did not significantly affect the survival rate or the final result of seedling growth. Therefore， this study was beneficial for the prevention and control of sweet potato viral diseases， the promotion of virus-free seed potatoes， and the reduction of seedling production costs.

Key words Sweet potatoes;Stem tip detoxification;Virus detection;Virus-free breeding system;Transplantation method of tissue culture seedlings

基金项目 华中农业大学横向项目“红安苕脱毒种苗生产、病毒检测和繁育技术体系研究”。

作者简介 曲玉阳（1997—），男，山东烟台人，硕士研究生，研究方向：甘薯脱毒组培快繁及栽培模式。*通信作者，副教授，博士，从事马铃薯种薯繁育与农机农艺融合研究。

收稿日期 2023-09-01

甘薯（Ipomoea batatas L.）是世界范围内一种重要的粮食作物，在全球粮食作物生产中，总产量排名第7位^［1］，其中中国是世界上最大的甘薯生产国^［2］。因甘薯具有高产稳产、耐热抗旱、适应性强及营养丰富等特点^［3］，在保障我国粮食安全方面发挥了重要的作用^［4］。红安苕是全国第一个授权的地理标志保护产品，因适宜红安县独特的环境和气候条件，已成为革命老区红安“1+X”的农业支柱产业。红安县甘薯种植面积有1万hm²，年产量达37万t^［5］。由于长期无性繁殖，导致品质退化、产量降低^［6］，严重制约了红安苕产业的高质量发展。

据报道，在全世界有30多种病毒侵染甘薯^［7］，我国报告了20种甘薯病毒^［8］，主要有甘薯羽状斑驳病毒（sweet potato feathery mottle virus，SPFMV）、甘薯褪绿矮化病毒（sweet potato chlorotic stunt virus，SPCSV）、甘薯潜隐病毒（sweet potato latent virus，SPLV）、甘薯褪绿斑病毒（sweet potato chlorotic fleck virus，SPCFV）和甘薯G病毒（sweet potato virus G，SPVG）等^［9］。尽早发现这些病毒并采取积极有效的防治措施是非常必要的，目前甘薯茎尖脱毒是防治病毒病最有效的方法^［10-11］。其原理是利用植物茎尖顶端分生组织中不含有病毒的特性，剥离茎尖，离体培养，再生出无病毒侵染的健康植株^［12］。

许多学者对甘薯脱毒进行了深入的研究，发现甘薯茎尖分生组织的再生效果受萘乙酸（1-Naphthaleneaceticacid，NAA）、6-苄基氨基嘌呤（6-Benzylaminopurine，6-BA）等激素的影响较大^［13］，适合的激素浓度配比才能获得最佳效果^［14］；脱毒后的再生苗需要检测，PCR技术可以检测到微量的病毒样本，其灵敏性是传统ELISA方法的1 000倍以上，具有简单、稳定，不受环境影响的优势^［15］；传统的甘薯组培苗移栽采用的是带根移栽的方式，需要进行洗根等处理，费时费工，而不带根移栽可以有效规避上述问题，并且该方法已经在马铃薯上有成熟的应用^［16］。鉴于此，笔者以红安主栽品种为试验材料，研究适合的甘薯组培脱毒及病毒检测体系，筛选优良株系和改进组培苗移栽方式，以期在源头上为红安县的甘薯优质种苗生产提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

该研究用于茎尖脱毒的材料由湖北黄安苕生物科技有限公司和红安县瑞沣种植养殖专业合作社提供，分别为紫檀红、姜牌红、骑龙红、西瓜红、龙薯9号、商薯19号、烟薯25号、鄂薯6号、瑞薯4号、粉薯、紫薯1和紫薯2。

SPFMV、SPCSV、SPCFV、SPLV、SPVG 5种病毒的甘薯阳性对照毒源植株，由河南省农业科学院张振臣研究员惠赠。

1.2 试验方法

1.2.1 茎尖脱毒及培养。

选取拟脱毒主栽品种具有典型性状、完好、无病虫害的薯块，催芽后取茎尖部，在40倍解剖显微镜下剥取0.2～0.4 mm的茎尖分生组织，放在含有0.2 mg/L NAA（萘乙酸）和1.0 mg/L 6-BA（6-苄氨基嘌呤）的MS培养基上培养，置于20 ℃，相对湿度70%，光照时间16 h/d，光照强度2 000 lx条件下，诱导芽的分化。观察茎尖膨大和再生出芽情况，从而对比不同品种在分化培养基上的再生效果。

1.2.2 病毒检测。

采用RT-PCR技术进行病毒检测，具体方法参照刘训龙^［17］报道的方法进行。引物序列如表1所示。

PCR具体的反应体系为：样本cDNA 1 μL，病毒的上、下游引物各0.5 μL，Mix 5 μL，用ddH₂O补足至总体积10 μL。反应条件为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，54～56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35次循环；72 ℃终延伸10 min，4 ℃保存。反应结束后，取8 μL的PCR扩增产物在1.0%琼脂糖凝胶中进行电泳，电压150 V，电泳后将胶块放置在凝胶成像仪上观察拍照，将呈阳性的样品测序，测序结果在美国国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）网站上进行BLAST序列比对，判断引物特异性扩增出的产物是否为目标片段。