制样方法对菊花花蕾激光显微切割样品RNA提取质量的影响

摘要  ［目的］研究不同固定剂及切片制样方式对菊花花蕾激光显微切割样品RNA提取质量的影响。［方法］以丙酮和乙醇冰醋酸2种试剂固定菊花花蕾，采用石蜡和冰冻切片2种方式制作样本，显微切割并收集最外两轮小花原基，提取RNA后比较提取质量。［结果］石蜡和经梯度蔗糖保护的冰冻切片均能很好地保存花蕾组织形态，就石蜡切片而言，乙醇冰醋酸固定组织切割样品的RNA降解明显低于丙酮固定样品；而2种固定剂的冰冻切片切割样品RNA提取质量无明显差异。与石蜡切片相比，冰冻切片显微切割样品RNA质量更高。切割时收集管盖加入RNA提取缓冲液可明显缓解RNA降解。显微切割的不同品种菊花花原基与花发育有关的基因表达水平存在差异，表明切割获得的材料可用于下一步研究。［结论］植物组织经乙醇冰醋酸固定、梯度蔗糖保护后冰冻切片进行显微切割效果较佳，可富集特异组织或细胞并从中获得较高质量的RNA。

关键词  固定剂；石蜡切片；冰冻切片；激光显微切割；RNA；提取质量

中图分类号  Q94-336  文献标识码  A

文章编号  0517-6611（2024）18-0001-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.18.001

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Effect of Sample Preparation Methods on the Quality of RNA Extraction from Chrysanthemum Bud Laser Microdissection Samples

MA Yue-hua，DING Lian，ZHANG Xue et al

（College of Horticulture，Nanjing Agricultural University，Nanjing，Jiangsu 210095）

Abstract  ［Objective］To study the effect of different fixatives and section methods on RNA quality of flower primordia of Chrysanthemum buds collected by microdissection.［Method］Chrysanthemum buds was fixed by acetone or ethanol acetic acid and then paraffin section/frozen section was prepared for laser microdissection respectively.Outermost two whorls of flower primordia were identified and collected by laser microdissection.The quantity and quality of isolated RNA were assessed.［Result］Both tissues embedded in paraffin for paraffin section or OCT for cryosection preserves well the anatomical structure and morphology of the buds.For paraffin-section，ethanol acetic acid was a better choice being a fixative than that of acetone，as that RNA extracted from the microdissection samples was less degraded.There was no significant difference in RNA integrity of cryosection between these two fixatives.The tissues conducted cryosection could get higher quality of RNA compared with that of paraffin-section.Furthermore，when microdissection was conducted，containing the extraction buffer from RNA isolation kit in the cap of PCR tube could preserved RNA integrity of the samples.Genes expression of flowering locus T in flower primordia was different in species of chrysanthemum showed that samples captured by microdissection can be used for subsequent research.［Conclusion］Plant tissues fixed by ethanol-acetic acid and protected by gradient sucrose before cryosection could collect specific cell-type populations by laser microdissection.From those populations we could obtain enough RNA with high integrity.

Key words  Fixative；Paraffin section；Cryosection；Laser microdissection；RNA；Extraction quality

基金项目  中央高校基本业务费科技平台实验技术人才基金项目（10307201705）。

作者简介  马月花（1975—），女，青海海东人，高级实验师，博士，从事实验室和大型仪器管理工作。

收稿日期  2023-10-19

激光显微切割技术是通过在显微镜下识别目的组织或细胞，利用激光作为能量，从不同的组织中快速切割、分离和纯化生物体的目标组织、细胞，从而进行后续的分子生物学、质谱等分析的一种手段，它是显微观察和分子生物学、代谢组学等研究之间的桥梁。植物体内相似或相同形态结构及生理功能的细胞群构成了组织，组织结构越多越复杂则植物的适应性越强，各个组织来源、分工不同，但相互有机结合，协同完成植物的生命活动。以往多数研究往往取材于混合的异质组织进行细胞分析，其结果往往是数量较大的几类细胞的综合平均值。为研究某种细胞或组织的特殊功能，必须对特殊的细胞类型进行单一分离和分析。激光显微切割技术成功地解决了大块分离组织中的细胞功能异质性问题，自1996年以来广泛应用于肿瘤等医学研究，但在植物样品中的应用则起步较晚［1］。近些年来随着蛋白质组学技术、测序技术的发展，激光显微切割在植物方面的研究应用越来越广泛。Pires等［2］利用激光切割技术对木本植物如橡木的木栓形成层、皮孔、木质部、韧皮部分别进行取样并测序，Balestrini等［3］通过激光显微切割技术研究了不同类型细胞在植物和病原侵染过程中转录组和基因表达的反应，Verma等［4］收集了苹果芽分生组织并通过激光显微切割技术对其miRNAs的表达进行了分析；Cahill等［5］利用激光切割结合质谱对单个洋葱表皮和衣藻细胞进行了代谢组研究；Zhong等［6］利用激光切割结合荧光定量PCR、液相色谱-质谱联用分别测定了小麦籽粒糊粉层、外胚乳、中胚乳、内胚乳和传递细胞的基因表达及其游离和结合蛋白质的氨基酸水平，揭示了胚乳中蛋白质合成和氨基酸运输的途径，为高品质小麦的改良提出了目标。冰冻切片和石蜡切片是显微切割组织的主要制片方法，但二者的核酸回收率和组织形态结构保持性在不同的植物种类和组织间具有很大差异［7］。将包埋材料由石蜡换为更低熔点的Steedman’s wax时得到的切片组织完整性和RNA质量更高［8］。如何建立一种高效、经济的基于激光显微切割技术切取特异组织或细胞，并从中提取到足够数量和完整性的RNAs是将此技术广泛应用于研究的难点［7］。该研究以激光显微切割菊花花原基进行后续测序等分子生物学研究为目的，比较了样品固定液、制片方法、切割过程中的保护措施等对收集的花原基提取RNA质量的影响，以期探寻一种获取高质量RNA适于下游分子生物学相关研究的植物显微切割样品制备方法。

1  材料与方法

1.1  试验材料  显微切割制样方法部分以南京农业大学菊花品种“泰白”为材料，基因表达部分以“泰白”“神马”“金松月”3个菊花品种为材料，取4～6 mm花蕾。2种固定液分别为无水乙醇/冰醋酸（3∶1，V/V）和丙酮。

冰冻切片机采用德国Leica品牌，型号CM3050S；全自动激光显微切割系统采用德国Leica品牌，型号LMD7000；生物分析仪系统采用美国Agilent品牌，型号2100；荧光定量仪采用瑞士罗氏品牌，型号LightCycler 96。

1.2  试验方法

1.2.1  石蜡制片样品的准备。

1.2.1.1  固定。

将组织样品切成3 mm×3 mm×3 mm的正方体块，分别投入4 ℃预冷的2种固定液中，抽真空20 min，随后更换新鲜的固定液，４ ℃摇床上振荡过夜。

1.2.1.2  脱水。

利用由低到高的乙醇梯度对样品进行脱水，每个梯度180 min，这一过程是将脱色摇床置于4 ℃冰箱内进行。乙醇梯度依次为50%乙醇＋10% 8.5% NaCl+40%焦碳酸二乙酯（DEPC）水、70%乙醇＋10%  8.5% NaCl+20% DEPC水、85%乙醇＋10% 8.5% NaCl+5% DEPC水、95%乙醇、100%乙醇，最后再更换新鲜的100%乙醇于４ ℃摇床上过夜。

更换新鲜的无水乙醇在室温下置摇床上处理2.5 h，随后将样品放入无水乙醇∶二甲苯（1∶1）溶液中振荡处理1.5 h，连续更换4次二甲苯，每次振荡处理1.5 h，最后一次更换时加入约1/4体积的固体石蜡片，室温下振荡过夜。同时在60 ℃烘箱中融化固体石蜡片，制备液体石蜡以备后用。

1.2.1.3  包埋、切片。

将样品转移至42 ℃烘箱中，待石蜡片全部融化后更换已制备好的新鲜液体石蜡，并于60 ℃烘箱过夜。连续3 d每天早晚将样品换入新鲜的纯液体石蜡中，第4天早晨更换纯蜡后至少等待4 h再进行包埋。从包埋盒中取出蜡块，用加热的解剖刀将蜡块分割为若干小蜡块，每个小蜡块包含一个完整的组织。将小蜡块修整成正方体或者长方体后粘在小木块上，使用石蜡切片机进行切片，切片厚度为8 μm。用毛笔挑取石蜡片，放在摊片机上用37 ℃ DEPC水展片，待蜡片充分展平后，用PET膜在水中捞取石蜡切片，吸水纸吸干多余水分。将PET膜置于37 ℃烤片机上烤片1.5～2.0 h后放入4 ℃冰箱保存或进行下一步试验。这一过程中特别要注意的是，从水中捞取石蜡片后一定要将多余水分充分吸干，以免产生气泡影响制片的效果。

1.2.1.4  脱蜡。