1例土鸡禽白血病病毒与马立克病病毒混合感染诊断与分析

摘要  ［目的］对安徽某土鸡场送检的疑似肿瘤病的病料进行鉴定。［方法］采集病死鸡的肝脏，提取病毒DNA，根据Genbank已登录的基因序列设计引物，通过PCR检测，对扩增出的ALV env与MDV meq基因序列进行测序和序列分析。［结果］检测到禽白血病和马立克目的条带，序列比对结果发现，禽白血病病毒为J亚群，马立克为野毒强毒株。［结论］研究结果为了解该地区禽白血病和马立克混合感染情况提供了参考数据。

关键词  禽白血病；马立克；PCR；序列分析

中图分类号  S852.65  文献标识码  A

文章编号  0517-6611（2024）18-0058-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.18.013

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Diagnosis and Analysis of a Case of Mixed Infection ALV and MDV from Home-kept Chicken

HU Xiao-miao，YIN Dong-dong，SHEN Xue-huai et al

（Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine ， Anhui Academy of Agricultural Sciences/Livestock and Poultry Epidemic Diseases Research Center of Anhui Province/Anhui Province Key Laboratory of Livestock and Poultry Product Safety Engineering， Hefei， Anhui 230031）

Abstract  ［Objective］To identify samples of suspected tumor disease from a local chicken farm in Anhui Province.［Method］The chicken liver was collected and the virus DNA was extracted.The primers were designed according to the sequence of ALV and MDV that GenBank had registered.The ALV env and MDV meq gene were detected by PCR.The amplified sequence was sequenced and analyzed by evolutionary tree and nucleotide homology.［Result］Detected bands of ALV and MD， and sequence alignment results showed that ALV belongs to subgroup J， while MD is a strong wild virus strain.［Conclusion］This study provided reference data for understanding the mixed infection situation of  ALV and MDV in the area.

Key words  Avian leukosis（AL）;Marek’s disease（MD）;PCR;Sequence analysis

基金项目  安徽省重点研究与开发计划项目（202204c06020039）；安徽省家禽产业技术体系（AHCYJSTX-06）;安徽农科院平台项目（2023YL013）；国家蛋鸡产业技术体系合肥综合试验站（CARS-40-S10）。

作者简介  胡晓苗（1971—），男，安徽望江人，助理研究员，博士，从事家禽传染病研究。*通信作者，副研究员，硕士，从事畜禽传染病防治研究。

收稿日期  2023-11-09

目前，引起家禽传染性肿瘤病主要有2种，即禽白血病毒引起禽白血病（avian leukosis，AL）和疱疹病毒引起的马立克氏病（Marek’s disease，MD）［1-2］。禽白血病病原为反转录病毒禽白血病病毒，它能引起禽免疫抑制，发生多种肿瘤，是国家明确提出鸡场必须净化的疫病之一［3-6］。马立克氏病是由马立克氏病病毒引起的一种淋巴组织增生性疾病，近年来出现接种了疫苗但仍有MD发病的现象，临床上发病病理变化不典型［7］。这2种疫病都可使蛋鸡的产能降低，会造成鸡群不可逆性病变和死亡，是影响鸡场经济效益的重要疾病。

2023年9月，安徽某土鸡场鸡群从90日龄出现发病症状，连续发病近30 d，鸡群不断死亡，经临床症状、剖检变化、分子生物学诊断等方法将该病例确诊为禽白血病与马立克氏病混合感染，笔者对此进行了诊断与分析。

1  材料与方法

1.1  临床症状  发病鸡食欲不振，精神沉郁，被毛凌乱，闭眼，消瘦，3月龄5 000只每天死亡10只左右。

1.2  剖检病变  对病重和病死鸡进行剖检，肝脏和脾脏肿大，表面有灰白色肿瘤样坏死灶，心脏表面见灰白色肿瘤坏死灶，见图1、图2。综合流行病学特点、临床症状及剖检病变判为疑似肿瘤性疾病，具体确诊通过实验室诊断来确定。

1.3  实验室诊断  分子生物学诊断。

1.3.1  引物合成。根据GenBank上收录的ALV env基因、MDV meq基因设计引物序列，禽白血病F：CTTTCTCTCGGGTCGACTTC，R：GTAAGCAGTCCAAGGGTCAC，预扩增条带大小为592 bp，马立克F：TCGGTGAGTCTTCTCTC，R：TTCAGCTGCTCCCTAATTC，预扩增条带大小为348 bp。

1.3.2  目的基因扩增。取2 μL核酸配制PCR检测体系，分别添加ALV-env基因、MDV-meq基因扩增引物进行基因扩增。PCＲ反应体系（ 20 μL）：2×Taq DNA聚合酶Mixture 10 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA 1 μL，加双蒸水7  μL。PCR反应条件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 15 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，30个循环；72 ℃ 10 min。

1.3.3  PCR产物的电泳分析及测序。

取5 μL PCR产物扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，在紫外凝胶成像仪上观察结果，确定为目的条带后送上海生工生物工程有限公司测序。

1.3.4  序列分析。

对测序公司获得的序列在NCBI网站上对所测毒株进行BLAST比对，同时利用MEGA 7.0、MegAlign进行基因序列同源性分析并绘制进化树。

2  结果与分析

2.1  病毒鉴定结果

经检测，马立克氏病、禽白血病核酸检测为阳性，结果见图3。将马立克毒株命名为NKY-A，禽白血病毒株命名为 NKY-2022。

2.2  基因序列特征

将分离鉴定的ALV毒株命名为NKY2022株，其env基因与GenBank中13株ALV毒株进行序列比对分析，结果显示，NKY2022株

与国内分离的ALV-J亚群（如KX077613.seq）同处一个分支，亲缘关系最近（图4）。同源性分析结果显示，NKY2022株与ALV-J亚群的核苷酸同源性为96.2%～100%，与其他亚型的同源性为54.7%～55.7%（图5）。

将分离鉴定的MDV毒株命名为NKY-A株，其meq基因与GenBank中15株MDV毒株进行序列比对分析，结果显示，NKY-A株与国内外MDV毒株（如LC385872.1）不在同一分支（图6），同源性结果显示，NKY-A株与参考强毒株的核苷酸同源性为97.6%～99.0%（图7）。

3  讨论

近年来虽然国内出现接种疫苗，但是鸡群依然发病的情况时有发生，尤其多病原的混合感染造成鸡生长抑制，产蛋性能下降，出现免疫抑制现象，甚至引发鸡群产生肿瘤和死亡等，给养鸡业造成了巨大损失［8-10］。该研究通过对发病鸡进行病原核酸检测，结果表明，发病鸡存在ALV-J与MDV的混合感染。土鸡是肉蛋兼用型鸡，深受群众喜爱，如果存在这2种疫病的混合感染，将会对家禽业造成巨大的经济损失。安徽省是土鸡养殖大省，土鸡品种丰富，拥有众多的国家级或省级土鸡保种场，土鸡免疫抑制病的防控对土鸡品种的保护和乡村振兴具有重要意义。

ALV缺乏可供使用的疫苗，也没有特效的治疗药物，只能靠净化。在生产中，禽群中一旦发生ALV，一般只能作淘汰处理。MD是唯一可以用疫苗进行防治的肿瘤性疾病。虽然MD有可供使用的疫苗，但由于鸡群存在垂直传播性疾病，影响鸡群免疫系统免疫应答，疫苗难以产生足够抗体抵抗野毒株感染而导致免疫失败。ALV和 MDV都能使鸡群机体产生免疫抑制，共同感染2种病毒可加重发病严重程度，还能引起其他疫病混合感染［11］，故应引起足够的重视。

参考文献

［1］

陈溥言.兽医传染病学［M］.6 版.北京： 中国农业出版社，2006：379-400.

［2］ 崔治中. 鸡肿瘤病的鉴别诊断与我国鸡群中肿瘤病发生的现状（一）［J］.中国家禽，2004，26（10）：53-54.

［3］ 杨玉莹. J 亚群禽白血病病毒研究进展［J］.中国病毒学，2003，18（1）：93-97.

［4］ 梁雄燕，杨玉莹，顾玉芳，等. 湖北部分肉种鸡群J亚群禽白血病血清学调查及PCR检测［J］.湖北农业科学，2009，48（11）：2636-2638.

［5］ 顾玉芳，杨玉莹，赵振华，等.IMC10200株ALV-J实验诱发禽骨髓性白血病的研究［J］.中国预防兽医学报，2004，26（4）：278-281.

［6］ 王培坤，毕玉彧，秦丽莉，等.三黄鸡临床血管瘤病例中分离出A亚群与J亚群禽白血病病毒［J］.动物医学进展，2015，36（3）：13-16.

［7］ 李敏，高延利，石梦雅，等.黄羽肉鸡马立克氏病病毒强毒株 GX18NNM4 的分离鉴定及其致瘤基因 meq 的序列分析［J］.中国家禽，2021，43（3）：28-34.

［8］ 张喜懿，温贵兰，文明，等.绿壳蛋鸡MDV与J亚群外源性ALV混合感染病原的鉴定及主要基因序列分析［J］.黑龙江畜牧兽医，2021（13）：68-74，147.

［9］ 张利，张洪海，刘青，等.山东省肉种鸡群三种家禽肿瘤性疾病流行病学调查［J］.中国预防兽医学报，2011，33（4）：265-269.

［10］ 张洪海，刘青，邱波，等.地方柴鸡中 J 亚群禽白血病与马立克氏病的混合感染［J］.畜牧兽医学报，2009，40（8）：1215-1221.

［11］ 韦平，阳秀英，蒋玲艳，等. 我国商业鸡群多种免疫抑制性病毒共感染的研究［J］. 中国家禽，2007，29（8）：10-13，27.