麦类壳多胞斑点病菌的快速检测方法研究

摘要  利用麦类壳多胞斑点病菌β-tubulin一段保守基因序列，设计特异性引物进行麦类壳多胞斑点病菌的检测，并进行特异性与灵敏度验证。结果显示，该方法特异性强，灵敏度可达5 pg/μL，适合于麦类壳多胞斑点病菌的快速检测。

关键词  β-tubulin基因；麦类壳多胞斑点病菌；特异性；灵敏度

中图分类号  S41  文献标识码  A

文章编号  0517-6611（2024）18-0118-02

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.18.025

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Study on the  Rapid Identification Method of Parastagonospora pseudonodorum

LI  Jin-qing1，2，WANG Ying-chao1，3，SHAO Xiu-ling1 et al

（1.Technical Center of Qingdao Customs，Qingdao，Shandong 266109；2.Technical Center of Yantai Customs，Yantai，Shandong 264000;3.Linyi Vocational University of Science and Technology，Linyi，Shandong 276000）

Abstract  This study utilized partly conserved gene sequence of β-tubulin in Parastagonospora pseudonodorum，designed specific primers for the detection of Parastagonospora pseudonodorum，with specificity and sensitivity verified.The results showed that this method had strong specificity and a sensitivity of up to 5 pg/μL and suitable for rapid detection of Parastagonospora pseudonodorum.

Key words  β-tubulin gene;Parastagonospora pseudonodorum;Specificity;Sensitivity

基金项目  国家重点研发计划（2021YFD1400100，2021YFD1400103）；青岛海关科研项目（QK202053，QK202016）。

作者简介  李金庆（1982—），男，山东安丘人，高级农艺师，硕士，从事植物检疫研究。*通信作者，研究员，从事植物检疫研究。

收稿日期  2023-10-20；修回日期  2023-11-20

麦类壳多胞斑点病菌可为害小麦、大麦等禾本科植物，引起小麦等作物的斑点病，生长后期可引起坏死症状，导致小麦等严重减产［1-3］。病菌主要危害叶片和叶鞘上部，叶斑椭圆形，常聚结，稻草色或浅黄色，中央部分有球果状分生孢子器，通常为灰色到黑色［4］。麦类壳多胞斑点病菌现已逐渐成为世界性病害，已在非洲［1］、美洲［1-3］、亚洲［1，5］、欧洲［6-8］、大洋洲［1］有分布，并被列入我国进境植物检疫性有害生物名录，是一种重要的检疫性菌物。近年来由于菌物分类研究的快速发展，许多检疫性菌物的分类地位已经发生变化［9］，麦类壳多胞斑点病菌的学名Stagonospora avenae Bissett f. sp. triticea T. Johnson已更新为Parastagonospora pseudonodorum B. A. McDonald，P. C. Brunner，Croll，D. Pereira & Crous ［10-11］。目前麦类壳多胞斑点病菌还未有分子检测等方面的研究。

随着分子生物学发展，β-微管蛋白基因（β-tubulin）、Histone H3、核糖体DNA内转录间隔区（ITS）序列、EF-1α和nadh1等被广泛应用在菌株间的亲缘关系和病原菌的分子鉴定。由于麦类壳多胞斑点病菌与近似种之间的ITS序列同源性较高，较难通过ITS序列将麦类壳多胞斑点病菌与近似种区分［12］，因此有必要选择其他的基因片段进行麦类壳多胞斑点病菌的检测。微管是细胞骨架、纺锤体等的主要组分，微管蛋白是微管的组成单位，由α-tubulin蛋白和β-tubulin蛋白组成，其中β-tubulin蛋白由β-tubulin基因所编码［13］，可影响菌丝生长及形态、孢子形成和附着胞分化等［14］。由于β-tubulin基因既有保守的外显子又有许多内含子，广泛用于物种鉴定和真菌各级分类水平上的系统发育研究［15-19］。曹继芬等［20］以β-tubulin基因为靶标设计了特异性引物Tbas-tub2F/Tbas-tubR用于根黑腐病菌的PCR 检测，对其检测特异性、灵敏度、早期诊断技术进行了测试，该引物对根黑腐病菌基因组DNA 检测的灵敏度为10 fg/μL，可从接种侵染24 h后的烟草组织中检测到根黑腐病菌，从而对根黑腐病进行准确的早期诊断。彭军等［21］研究利用β-tubulin保守序列建立一种 PCR检测方法用于从感病组织及根际土壤中检测香蕉枯萎菌，可以从海南、广东分离的18个菌株中扩增到单一明显的497 bp条带，并在此基础上建立了巢式PCR，提高了检测灵敏度。目前还未有利用β-tubulin基因用于麦类壳多胞斑点病菌检测方法的研究。

笔者在麦类壳多胞斑点病菌新的分类进展的基础上，基于β-tubulin基因探索开发麦类壳多胞斑点病菌的特异性检测方法，填补该病菌没有特异性检测方法的空缺，以期为口岸检疫鉴定提供快速检测方法。

1  材料与方法

1.1  试验材料

麦类壳多胞斑点病菌（Parastagonospora pseudonodorum）（宁波海关技术中心赠送）；6种进境大麦中经常截获的病菌［22］：侵染链格孢菌（Alternaria infectoria）、互隔链格孢菌（Alternaria alternata）、大麦网斑病菌（Pyrenophora teres）、麦根腐平脐孺孢菌（Bipolaris sorokiniana）、梨孢镰刀菌（Fusarium poae）、大麦黑变病菌（Cladosporium herbarum）；3种小麦上发生的病菌：小麦基腐病菌（Oculimacula yallundae）、小麦全蚀病菌（Gaeumannomyces graminis var.tritici）、假禾谷镰刀菌（Fusarium pseudograminearum）。

1.2  DNA提取

利用天根生化科技（北京）有限公司生产的高效植物基因组DNA提取试剂盒（DP350-02）刮取在PDA平板上生长的病原菌菌丝进行DNA提取。提取完成后测定其浓度与纯度，-20 ℃保存备用。

1.3  引物设计与合成

根据麦类壳多胞斑点病菌一段β-tubulin基因保守序列，用NCBI的Primer-Blast功能模块设计Parastagonospora pseudonodorum的特异性引物，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。Psp-tub-F：5′- TGGTCCAAATTGCACAACGC-3′，Psp-tub-R：5′- GGGTGATCTGGAAACCCTGG-3′。

1.4  引物特异性验证

以麦类壳多胞斑点病菌、侵染链格孢菌、互隔链格孢菌、大麦网斑病菌、麦根腐平脐孺孢菌、梨孢镰刀菌、大麦黑变病菌、小麦基腐病菌、小麦全蚀病菌、假禾谷镰刀菌的基因组DNA及ddH2O为模板，分别用特异性引物Psp-tub-F、Psp-tub-R进行常规PCR反应。

PCR扩增采用25 μL PCR反应体系：Premix Mix 12.5 μL、引物Psp-tub-F／Psp-tub-R各1.0 μL，DNA模板1.0 μL，加入ddH2O补齐至25 μL。将反应体系混合均匀后置于普通PCR仪中进行反应。

PCR反应条件：95 ℃ 2 min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，循环35次；72 ℃ 5 min。

1.0%琼脂糖凝胶电泳检测普通PCR产物，进行引物特异性验证。

1.5  引物灵敏度验证

以麦类壳多胞斑点病菌DNA模板（50 ng/μL）做10倍浓度梯度稀释，共8个稀释度，将DNA原液及稀释液作为模板，依照方法“1.4”中设计的反应体系和反应条件来检测麦类壳多胞斑点病菌PCR反应的灵敏度。

2  结果与分析

2.1  特异性验证检测结果

特异性验证结果表明，建立的麦类壳多胞斑点病菌PCR检测方法具有高度的特异性，只有麦类壳多胞斑点病菌DNA模板的反应中出现片段大小为291 bp的特异性条带，而其他9种病菌及ddH2O均未出现特异性条带（图1）。

注：M.DL 2000 DNA Marker。a.麦类壳多胞斑点病菌; b.侵染链格孢菌; c.互隔链格孢菌; d.大麦网斑病菌; e.麦根腐平脐孺孢菌; f.梨孢镰刀菌; g.大麦黑变病菌; h.小麦基腐病菌; i.小麦全蚀病菌; j.假禾谷镰刀菌;k.ddH2O。

Note：M.DL 2000 DNA Marker.a. Parastagonospora pseudonodorum;b.Alternaria infectoria;c.Alternaria alternata;d.Pyrenophora teres;e.Bipolaris sorokiniana;f.Fusarium poae;g.Cladosporium herbarum;h.Oculimacula yallundae;i.Gaeumannomyces graminis var.tritici;j.Fusarium pseudograminearum;k.ddH2O.

2.2  灵敏度验证检测结果

灵敏度验证结果表明，模板DNA原液及10-1、10-2、10-3、10-4稀释度均出现特异性条带，而10-5、10-6、10-7、10-8稀释度均未出现特异性条带。由此可见，10-4稀释度是该试验的检测下限。换算后可知，麦类壳多胞斑点病菌PCR试验的灵敏度可达5 pg/μL（图2）。

注：M.DL 2000 DNA Marker；a.DNA原液；b.10-1；c.10-2；d.10-3；e.10-4；f.10-5；g.10-6；h.10-7；i.10-8。

3  讨论

麦类壳多胞斑点病菌是我国进境植物检疫性有害生物名录中的一种检疫性真菌病害，检疫意义重大。为保护我国粮食产业不受麦类壳多胞斑点病菌入侵和危害，保护农业生态，促进对外贸易的正常开展，需要加强对麦类壳多胞斑点病菌的检疫，严防其传入国内。我国已于2014年颁布了麦类壳多胞斑点病菌的鉴定标准（SN/T 3892—2014），该标准是建立在形态学、生物学等基础上的常规鉴定手段，为提高货物检疫的准确性和通关放行速度，建立一套快速、完整、准确的分子特异性检测方法迫在眉睫。