锰氧化细菌定殖对漂浮植物大薸去除水中锰和氨氮的影响

摘要 将2株具有植物促生长潜力的锰氧化细菌（manganese oxidizing bacteria，MOB）——微小杆菌属（Exiguobacterium）OS和松鼠葡萄球菌（Staphylococcus sciuri）WLS01分别定殖到漂浮植物大薸根部，通过观察和测定水培14 d前后植物的生长和生理响应、水中锰和氨氮含量、植物对锰的转运的变化来研究MOB定殖对植物的影响。结果表明：定殖OS和WLS01后大薸生物量增长比例分别达到31.29%和25.81%，远高于未定殖组，同时增强了其光合作用。但定殖MOB后的大薸根部出现损伤。

关键词 锰氧化细菌；植物促生长潜力；漂浮植物；大薸；锰污染；氨氮；微生物-植物修复

中图分类号 X 53  文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2024）20-0059-06

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.20.014

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Effect of Colonization of Manganese Oxidizing Bacteria on the Removal of Manganese and Ammonia Nitrogen from Water by Floating Plant Pistia stratiotes

CHEN Xue-min，TANG Yan-kui，YIN Juan-juan et al

（School of Resources，Environment and Materials，Guangxi University，Nanning，Guangxi 530004）

Abstract Exiguobacterium sp.（OS） and Staphylococcus sciuri （WLS01），which were two strains of manganese oxidizing bacteria （MOB） with plant growth promoting potential，were inoculated in the roots of the floating plant Pistia stratiotes，respectively，the effects of MOB colonization on plants were studied by observing and measuring the growth and physiological response of plants before and after 14 days of water cultivation，changes in manganese and ammonia nitrogen content in water，and changes in manganese transport by plants.The results showed that colonization of OS and WLS01 led to an increase in P.stratiotes biomass by 31.29% and 25.81%，respectively compared to the uncolonized group，and the colonization also improved the plant photosynthesis.But after colonization MOB，damage appeared in the roots of  P.stratiotes.

Key words Manganese oxidizing bacteria;Plant growth-promoting potential;Floating plant;Pistia stratiotes;Manganese pollution;Ammonia nitrogen;Microbial plant remediation

锰是国民经济不可或缺的金属材料，但在锰冶炼过程会产生电解锰渣，若处置不当，进入环境的锰和氨氮会对水体造成污染。水生植物具有良好的污染物去除能力且生态友好、成本低廉，已广泛应用于水环境生态修复中［1-5］。已有报道漂浮植物大薸可以有效去除水中包括锰在内的重金属［5］，且植物易于收获［6］，但高浓度锰暴露会对植物生长产生不利影响［7］。近年来，锰氧化细菌 （manganese oxidizing bacteria，MOB） 具有固定水中游离锰的能力不断被报道［8-9］，不少学者已经在尝试利用水生植物发达的根系为微生物提供的良好栖息场所（根际泌氧），将具有植物促生长能力的MOB定殖到锰富集植物组织如沉水植物狐尾藻［10］中，不仅解决了高浓度锰的存在影响植物生长（降低生物量），进而降低植物修复效率的问题，实现更高效的细菌-植物联合修复。植物促生菌（Plant growth-promoting bacteria，PGPB）是指生存在植物根际范围内，对植物生长有促进或对病原菌有拮抗作用的有益的细菌统称。与植物伴生的PGPB可以通过产生一系列的化感物质，如抗生素、氰化氢、裂解酶和铁载体等来促进植物生长［11］，PGPB还通过合成抗生素，如硝基吡咯、非那嗪、间苯三酚、环脂肽和脂肽等物质来防止植物被其他细菌和真菌侵染［12］。通过人为定殖同时兼具锰氧化能力和植物促生长潜力的菌株来促进漂浮植物生长并提高其锰富集能力以实现更高效的植物修复效率，是一个值得探索的研究领域。该研究将具有锰氧化和植物促生长能力的菌株OS（革兰氏染色阴性） 和 WLS01（革兰氏染色阳性）定殖到大薸根系，考察菌株对大薸生长生理响应以及氨氮去除和锰富集能力的影响。

1 材料与方法

1.1 试验材料

从广西大新县某锰矿区受锰污染溪流不同基质中筛选到2株锰氧化细菌（MOB），分别为松鼠葡萄球菌（Staphylococcus sciuri）WLS01菌株、微小杆菌属（Exiguobacterium）OS菌株，其来源和促生长能力见表1。大薸（Pistia stratiotes）为广西本土生长。

1.2 试验方法

1.2.1 微生物的扩培。

取出于-80 ℃甘油管中保存的菌株OS和WLS0 分别划线定殖至LB固体培养基，于35 ℃无菌培养箱中培养12 h。挑取固体培养基上生长的单菌落，定殖于LB液体培养基中过夜培养，使用无菌生理盐水调节菌悬液在600 nm下的光密度（OD）为1.000 ± 0.00 待用。

1.2.2 植物的培养。

采集长势良好的大薸植株，用自来水多次冲洗，去除植物表面的泥沙等杂质，并使用10% Hoagland营养液在光照培养箱（昼/夜温度25 ℃∶22 ℃，光/暗比12 h∶12 h，光照强度为15 000 lx）中浮水预培养10 d，从中挑选长势一致的植物，去除腐叶并使用超纯水冲洗表面后，称取约50 g鲜重的植物，测定其初始生长指标（重量、根长），并观察其初始生长情况。

1.2.3 细菌定殖。

将植物根部浸泡于1∶100（V/V）菌液中30 s，连同菌液一起放入含有Mn2+（30 mg/L）和氨氮（20 mg/L）的Hoagland营养液的水中培养（MnCl2和NH4NO3作为锰及氨氮来源），以未定殖菌液的植物作为对照组。期间以陈放8 h以上的自来水补充以维持水量不变。培养14 d后，取出植物，测定生长指标，记录生长情况变化后，用吸水纸吸干表面水分，将植物组织杀青（105 ℃至恒重）、研磨粉碎，得到植物组织干样品，保存待测。

1.3 分析方法

1.3.1 水质参数。采用精密pHS-3C型pH计、DDS-307型电导率仪和水质分析仪分别测定培养前后培养液的pH、电导率、溶解氧。采用纳氏试剂分光光度法（HJ 535—2009）测定氨氮含量。

1.3.2 锰含量。水中：采用火焰原子吸收分光光度法测定锰含量。植物组织：用陶瓷剪刀分别剪下培养桶中每一株植物的根和叶，用吸水纸吸干表面水分，剪碎，105  ℃烘干至恒重。称取0.1 g样品置于PTFE管中，加入9 mL HNO3、3 mL HCl和1 mL HF，在170  ℃下消解至溶液澄清透明，无可见固体。将消解液定容至50 mL，接着用0.45 μm水系针式滤膜进行过滤，使用火焰原子吸收分光光度法测定锰含量，每个样品测定3次。

1.3.3 植物生长指标。

1.3.3.1 根长。植物培养前以及植物培养结束后，进行称重及清洗，用吸水纸吸干表面水分后，用直尺（精度 0.1 cm）测量植物的根长，取最大值。

1.3.3.2 生物量。用吸水纸吸干收获的大薸表面水分后，立刻称重测定生物量。

1.3.4 植物生理指标的测定。

1.3.4.1 光合色素。

取0.5 g大薸叶片，剪碎后加入95%以上的乙醇，避光提取12 h，离心后取上清液，使用分光光度计分别于665、649和470 nm波长下测定样品的吸光度，计算叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素的含量［15］。

1.3.4.2 丙二醛（MDA）含量。

称取0.5 g新鲜根部组织，加入5 mL预冷PBS缓冲液（pH=7.5）与适量100目石英砂，冰浴研磨成匀浆，将匀浆在8 000 r/min离心15 min，上清液即为提取液，使用南京建成生物工程研究所的MDA测定试剂盒（A003-1-1）测定MDA含量。

1.3.5 生物富集系数和生物转运系数。生物富集系数（BCF）反映植物对环境中重金属的蓄积能力，生物转运系数（TF）反映重金属从植物根部向叶部转移的能力，计算公式如下［16］：

BCF=CP/CS（1）

TF=CSL/CR（2）

式中：CP为整株植物重金属含量（mg/kg）;CS为水中重金属含量（mg/L）;CSL为植物茎叶中重金属含量（mg/kg）;CR为植物根部重金属含量（mg/kg）。

1.4 数据处理与质量保证

为保证试验数据的准确性，试验结果用3个平行的均值表示。使用IBM SPSS Statistics 27对试验数据进行显著性分析和Pearson相关性分析；使用Excel 2019和Origin 2022对处理后的数据进行作图。试验过程所用试剂与药品均为分析纯或优于分析纯，试验过程中用水根据需要使用去离子水或超纯水。试验前所有玻璃仪器均经稀硝酸浸泡，并依次用清水和超纯水清洗、烘干待用。

2 结果与分析

2.1 生长指标变化

2.1.1

植物生物量。从图1a可以看出，在模拟废水中培养14 d后，大薸生物量均明显增加。在未定殖MOB组（PS）、定殖OS组（PS-OS）、定殖WLS01组（PS-WLS01）中，大薸生物量增长量分别为13.74%、31.29%和25.81%，与未定殖MOB的试验组相比，定殖组的生物量增长比例提升了1倍，由此推断定殖OS和 WLS01均可促进大薸生长。

2.1.2 植物根长。

从图1b可以看出，在培养14 d后，虽然PS-OS 组、PS-WLS01组根长有所增加（分别由7.1和8.1 cm生长至12.2和13.5 cm），但PS组根伸长比（62.9%）大于PS-OS组（50.9%）和PS-WLS01组（53.9%），且在PS-OS组和PS-WLS01组沉积物中可观察到一些脱落的根部组织，说明定殖OS和 WLS01可能使大薸根部小部分产生解离。