芽孢杆菌属在烟叶发酵和醇化中的应用研究进展

摘要  芽孢杆菌属在烟叶发酵和醇化的过程中起到了十分重要的作用。综述了烟叶发酵和醇化过程中细菌群落的研究进展，对芽孢杆菌属在协调烟叶化学成分、增加烟叶香气物质含量、改善烟叶感官质量、缩短发酵醇化时间和抑制烟叶霉变等方面的应用研究现状进行了总结，并对芽孢杆菌属在雪茄烟叶发酵过程中的研究方向及应用进行了展望，以期为应用芽孢杆菌菌剂提升国产雪茄烟叶品质提供参考。

关键词  芽孢杆菌；烟叶发酵；烟叶醇化

中图分类号  TS41+4  文献标识码  A  文章编号  0517-6611（2024）21-0001-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.21.001

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Research Progress on Application of Bacillus in Fermentation and Alcoholization of Tobacco Leaves

ZHAO Liang1，JU Shao-xuan2，SHI Xiang-dong2 et al

（1.Zhejiang Tobacco Industry Co.，Ltd.Technology Center，Hangzhou，Zhejiang 310024;2.Key Laboratory of Tobacco Industry Cultivation，Henan Agricultural University，Zhengzhou，Henan 450046）

Abstract  Bacillus plays an important role in the fermentation and alcoholization of tobacco leaves.In this paper，the research progress of bacterial community in the process of tobacco leaf fermentation and aging was reviewed.The application of Bacillus in coordinating the chemical composition of tobacco leaves，increasing the content of aroma substances in tobacco leaves，improving the sensory quality of tobacco leaves，shortening the time of fermentation and aging，and inhibiting the mildew of tobacco leaves were summarized.The research direction and application of Bacillus in the fermentation process of cigar tobacco leaves were prospected，in order to provide reference for the application of Bacillus agents to improve the quality of domestic cigar tobacco leaves.

Key words  Bacillus;Tobacco fermentation;Tobacco alcoholization

基金项目  浙江中烟工业有限责任公司科技计划项目（QG/ZY-SK-005/06）。

作者简介  赵亮 （1983—），男，江西玉山人，工程师，硕士，从事雪茄烟产品技术研究。*通信作者，工程师，从事雪茄烟产品开发及技术管理研究。

收稿日期  2023-11-23

发酵和醇化是烟叶生产加工过程中不可或缺的环节，不仅可以改善烤烟烟叶品质［1］，提高卷烟质量，还对雪茄烟叶和雪茄成品质量起到重要的作用［2］。通过发酵和醇化，不同种类烟叶内在化学成分更协调，致香物质增加，杂气和刺激性下降，燃烧性改善，香气更加显露，工业可用性提高［3-4］。一般认为烟叶发酵机理主要包括酶作用［5］、微生物作用［6-8］和化学作用［9］。研究表明，烟叶发酵和醇化过程中，叶面微生物分解烟叶中的大分子物质，通过一系列物理和化学变化，改善了烟叶品质［10-11］。随着叶面微生物研究的深入，人们发现细菌种类的多样性和数量都要多于真菌种类，并且细菌在烟叶发酵和醇化品质改善中发挥着重要作用［12-13］。因此，有益细菌在烟叶发酵和醇化中的应用日益得到重视，期望通过对微生物功能的挖掘，实现烟草品质的更好提升。由于烟叶叶面微生物数量巨大［14］，各类细菌的功能也不尽相同，为更好地了解不同种类细菌在烟叶发酵和醇化过程中的作用。该研究以耐高温、耐强酸强碱的芽孢杆菌属［15］为着眼点，对烟叶叶面优势细菌的分离鉴定以及芽孢杆菌属在烟叶发酵和醇化中的应用效果进行综述，并对其应用和研究前景进行展望，旨在为有益细菌的挖掘、功能开发及其在雪茄烟生产提供参考。

1  烟叶发酵和醇化过程中细菌群落的研究

为了筛选功能微生物用于提高烟叶品质，学者采用不同的方法对烟叶发酵和醇化过程中的叶面微生物群落进行研究。1967年，English等［16］从发酵的美国康州阔叶中分离出的嗜热菌包括：8株枯草芽孢杆菌、5株凝结芽孢杆菌、4株巨大芽孢杆菌和3株环状芽孢杆菌。国内也有大量科研人员对发酵和醇化过程中的烟叶叶面微生物进行研究。韩锦峰等［17］研究表明，自然陈化和人工发酵时叶面微生物数量减少且以芽孢杆菌属为优势种群。随后，有学者对雪茄烟叶的叶面微生物进行分离鉴定，发现在烟叶堆积发酵前后，芽孢杆菌属为优势种群［18］。此外，张晓娟［19］在雪茄茄衣烟叶人工发酵过程中，发现细菌占绝对优势，分离出来的细菌均为芽孢杆菌，杜佳等［20］在此后的研究中验证了这一结论。张鸽等［21］使用常规分离方法对4个国家7种雪茄茄衣烟叶的叶面细菌进行鉴定，发现各国家烟叶叶面细菌种类存在差异，但主要由芽孢杆菌和葡萄球菌组成，且芽孢杆菌属为优势菌属。

随着分子生物学的发展，烟叶中微生物的多样性得以更为系统地分析。此类技术具有高效、通量大、收集更多数据的特征［22-23］。Huang等［24］采用不依赖培养的方法分离了陈化前后烟叶叶面微生物基因组DNA，通过限制性片段长度多态性分析，发现陈化前后芽孢杆菌和假单胞菌均为优势菌属。此后，陈小敏等［25］对不同调制方式的“黑老虎”烟叶进行16rDNA高通量测序，同样发现主要细菌类群为芽孢杆菌、假单胞菌和微球菌。张鸽等［26］则使用HTS（high-throughput sequencing）和传统微生物分离方法对不同发酵时期的墨西哥茄衣叶面细菌进行研究。HTS结果表明，随发酵的进行，叶面优势微生物由棒状杆菌属和假单胞菌属演替为葡萄球菌属。而传统分离结果表明，不同发酵时期细菌主要为芽孢杆菌属和葡萄球菌属。对比2种方法发现，传统微生物分离鉴定方法更能获得发酵过程中的部分微生物用于后期的功能研究，而HTS测序则在揭示微生物群落演替中发挥了重要作用。在随后的研究中，对雪茄烟叶发酵过程中烟叶叶面微生物的测序结果表明，雪茄烟叶发酵过程中叶面优势菌群发生演替，细菌群落多样性增加，群落结构发生变化，而芽孢杆菌属主要出现在发酵前期和中期［27-28］。

烟叶发酵主要为人工发酵，即在特定的温度和空气湿度的发酵室内，促使烟叶加快变化。而醇化则偏重于在自然环境下轻发酵，所处环境温度较低，烟叶进行缓慢变化。2种方式烟叶所处环境温湿度不同，叶面微生物活动不同。浦绍占等［29］通过对不同仓库的不同醇化时期烟叶叶面细菌进行测序，发现不同时期、不同地点烟叶叶面细菌的优势种群不尽相同，而芽孢杆菌属始终为优势种群。周家喜等［30］以不同仓库醇化时间不同的云南保山C3F烟叶为研究对象，发现烟叶醇化过程中细菌群落以假单胞菌属、鞘氨醇单胞菌属、寡养单胞菌属和芽孢杆菌属为优势菌属，且醇化后期芽孢杆菌优势度明显增加。此后，牟丹等［31］对不同仓库不同醇化时间的243个烟叶样品叶面微生物进行测序，同样发现芽孢杆菌属为优势细菌菌属。陈善义等［32］对不同氧气浓度下醇化的烟叶表面微生物进行测序，结果表明芽孢杆菌属、鞘氨醇单胞菌属和伯克霍尔德菌属是气调醇化阶段优势菌属，其中芽孢杆菌属和伯克霍尔德菌的占比在整个过程中先升后降，表明了不同醇化阶段活跃的微生物类群有所不同。此外，芽孢杆菌属和伯克霍尔德菌属则主要在醇化后期发挥作用。综上所述，国内外学者使用多种方法对不同烟叶叶面微生物进行了鉴定，发现无论是在人工高温发酵还是自然低温醇化过程中，芽孢杆菌属都能以优势微生物菌群存在。这可能与芽孢杆菌属在4～70 ℃的条件下生长，具有抗逆性强、营养需求简单和生长速度快等特性［15］，这使其能够适应大多数环境下不同烟叶发酵和醇化过程中温度、水分和pH等微生物生长条件的变化。因此，研究芽孢杆菌属在烟叶发酵和醇化中的作用及其应用对于提高烟叶品质至关重要。

2  芽孢杆菌属在烟叶发酵和醇化中的应用效果

芽孢杆菌属是一类好氧或兼性厌氧的细菌，能在极端条件下生存并产生抗逆性芽孢，其种属包含许多特殊功能菌株，能够大量产生淀粉酶和蛋白酶等。在工业、农业、医学等科学领域有重要研究和应用价值［33］。在烟叶发酵和醇化过程中可适当添加有益的芽孢杆菌，将烟叶中的蛋白质、糖和脂肪等有机大分子物质作为微生物生长和繁殖的营养成分，使其利用自身生长代谢降解大分子物质并产生生物酶来促进烟叶内部生化代谢，进而改善烟叶品质［34-37］。

2.1  协调化学成分

蛋白质在烟叶生长和发育过程中至关重要，但其含量过高时烟气强度过大，烟叶感官质量变差。研究表明，在烟叶发酵和醇化过程中添加芽孢杆菌属可有效降解烟叶中的蛋白质。冯志珍等［38］使用芽孢杆菌（F-Y-11 菌株）将烟丝发酵后使其蛋白质降解率提升到29.32%。同年，李宁等［39］将可产生蛋白酶的蜡样芽孢杆菌从烟叶叶面分离，然后将其用于雪茄烟叶发酵，使烟叶的蛋白质降解率增加了12.94%。杨宗灿等［40］从烟叶上分离出短小芽孢杆菌制成的菌液同样也可使发酵后烟叶中蛋白质降解率达29.66%。王颖等［41］研究了单一菌株和复配菌株对卷烟叶组化学成分的影响，发现芽孢杆菌属会将大分子蛋白质分解为氨基酸等小分子物质，这导致烟叶蛋白质含量下降。因此，通过使用芽孢杆菌属降解烟叶蛋白质，不仅可以减少蛋白质本身对烟叶品质带来的不利影响，而且其生成的游离氨基酸、短肽等小分子物质还可参与美拉德反应生成致香物质等［42］，这些过程对烟叶品质的改善具有重要意义。目前，我国已有应用枯草芽孢杆菌［43-44］、短小芽孢杆菌［45］和高地芽孢杆菌［46］等制成的菌剂来降解烟叶中蛋白质的实践。

烟叶中的淀粉含量过高会对其制品的燃烧性和安全性产生不良影响，并产生焦糊气味等。而利用芽孢杆菌属可产淀粉酶的特性，对烟叶添加有益芽孢杆菌是有效促进淀粉降解、改善烟叶品质的有效手段之一。研究表明，添加单一菌株和复配菌株发酵时，芽孢杆菌不仅起到降解蛋白质的作用，还可以有效降解烟叶中的淀粉［41］。另外，在烟叶发酵时使用苏云金芽孢杆菌处理烟叶，可利用其高效产淀粉酶的特点，使发酵后烟叶淀粉降解率高达29.84％［47］。张晓瑞等［48］发现，将从烟叶上分离出的枯草芽孢杆菌HX-6用于发酵烟叶，可使烟叶淀粉降解率达31.75%。此外，芽孢杆菌也可产生相应的酶降解烟叶中的纤维素、果胶和木质素等成分，从而使烟叶的内在化学成分趋于协调。烟叶中果胶含量过高会严重影响烟草吸食品质和陈化速度，张耀广等［49］将叶面枯草芽孢杆菌从烟叶中分离出来作为菌剂用于烟叶发酵，使烟叶的果胶含量降低，从而提高烟草和烟草制品的质量和安全性。雪茄烟中茄衣烟叶需要具有较好的韧性，而烟叶叶脉较粗、半纤维素含量过高时烟叶韧性较差，工业可用性变差。李志豪等［50］研究发现，蜡样芽孢杆菌B.cereus可降低雪茄茄衣烟叶中的纤维素和半纤维素含量，这为利用芽孢杆菌属有效降解烟叶中的半纤维素和纤维素、改善茄衣烟叶的物理特性提供了有效途径。除此之外，利用产纤维素酶和漆酶的芽孢杆菌Bacillus sp.GYC30降解烟草薄片原料中的纤维素和木质素的技术也已得到应用［51］。