不同预处理方式对青烟叶及烟田废弃物中生物活性物质含量的影响

摘要 为支撑青烟叶及烟田废弃物中生物活性物质的提取开发，以福建龙岩及三明产区田间烟株烟秆、烟杈烟花及底脚叶等废弃物与正常烟叶，杀青、冷冻及烘烤等不同预处理方式样品为试验材料，检测了其中茄尼醇、6种酚酸和4种黄酮类化合物含量。结果表明：所有样品中茄尼醇、绿原酸和芦丁的含量相对较高，为3种主要的生物活性物质；烟杈烟花及烟秆样品中的3种主要成分含量均低于0.05%，且杀青处理后变化不大；烟叶中的3种主要成分含量远高于烟杈烟花和烟秆，且在杀青或烘烤处理后含量进一步提高。底脚叶杀青后的茄尼醇、绿原酸和芦丁含量与正常烟叶中的含量相当，具有进一步利用潜力。

关键词 烟田废弃物；底脚叶；茄尼醇；绿原酸；芦丁；杀青

中图分类号 TS 49  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2024）23-0176-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.23.038

Effects of Different Pretreatment Methods on the Contents of Bioactive Substances in Green Tobacco Leaves and Tobacco Field Wastes

SUN Ya-qing，XU Wei-jie，CHEN Bin et al

（Technology Center of Shanghai Tobacco Group Co.，Ltd.，Shanghai 201315）

Abstract In order to support the extraction and utilization of bioactive substances from green tobacco leaf and tobacco field waste samples，the contents of solanesol，six phenolic acids and four flavonoids in different morphology and pretreatment methods of tobacco from Longyan and Sanming areas of Fujian Province were determined.The results showed that：The contents of solanesol，chlorogenic acid and rutin in all samples were relatively high，and they were the three main bioactive substances.The contents of the three main components in stem，branch and flower samples were all below 0.05%，and there was little change after de-enzyming treatment.The contents of components in leaf samples were much higher than those in stem，branch and flower samples，and further increased after de-enzyming or curing.The contents of solanesol，chlorogenic acid and rutin in bottom leaves after de-enzyming were equivalent to those in leaf samples.Bottom leaves had the potential of utilization.

Key words Tobacco field waste;Bottom leaf;Solanesol;Chlorogenic acid;Rutin;De-enzyming

基金项目 上海烟草集团有限责任公司科技项目（K2019-1-023P）。

作者简介 孙亚庆（1994—），男，上海人，助理工程师，硕士，从事烟草原料质量分析研究。*通信作者，高级工程师，硕士，从事烟草配方和工艺研究。

收稿日期 2024-01-10

为优化烟叶等级结构，提高优质烟叶有效供给能力，目前在烤烟生产的田间环节，会摘除下部2～3片光照不好、营养不良及顶部1～2片开片不好的不适宜烘烤的烟叶。这部分烟叶多丢弃于田间地头或是集中焚烧销毁，易引起周围烟田病虫害的发生，对土壤环境净化产生不利影响。统计资料显示，在采收过程中，田间不适用烟叶约占青烟叶总量的5%［1］。对这些废弃青烟叶进行科学合理的处置利用，不仅可以使得资源价值达到最大化，还能进一步实现绿色、清洁、可持续发展的烟草农业生态循环体系。

尽管不适用于卷烟生产，田间不适用烟叶中所含有的特征化学成分及生物活性物质仍显示出潜在应用价值，烟草植株中包含的有效物质如芦丁［2］、绿原酸［3］、烟碱和茄尼醇［4］等的综合利用已经得到了广泛研究。目前，已经有研究报道了初烤原烟［5］、废弃烟末［6］中生物活性物质的提取利用，但对于田间不适用烟叶、烟秆及烟杈烟花中生物活性物质的提取与分析尚未见系统研究。该研究以烟田废弃物中的底脚叶、烟秆及烟杈烟花和正常生产的青烟叶为主要研究对象，对比了不同预处理方式对其中生物活性物质含量的影响，为烟叶资源多用途综合利用提供支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验分别在福建省龙岩市长汀县三洲镇和福建省三明市泰宁县余上村开展。对于鲜烟样品，按照正常的生产进度，从烟株采摘后，即刻取样并在-80 ℃冷冻保存。对于杀青样品，按照正常的生产进度，从烟株采摘后，即刻进行杀青处理并在常温保存。试验样品信息见表1。

1.1.1 试验仪器。Agilent 1260 HPLC，安捷伦（中国）有限公司；Agilent 1290 UPLC，安捷伦（中国）有限公司；API 4000三重四级杆质谱，SCIEX公司；万分之一天平ME104，梅特勒-托利多国际贸易（上海）有限公司；百万分之一天平XPR2，梅特勒-托利多国际贸易（上海）有限公司；超声波清洗仪，KQ-300 BD，昆山市超声仪器有限公司；高速离心机，SIGMA 3K15，SIGMA。

1.1.2 试验试剂。乙腈和甲醇均为质谱纯，购自Merck公司。甲酸为质谱纯，购自CNW公司。茄尼醇（纯度≥95.0%和纯度≥90.0%）、新绿原酸（纯度≥98.0%）、隐绿原酸（纯度≥98.0%）、异绿原酸A（纯度≥91.0%）、异绿原酸B（纯度≥98.0%）、异绿原酸C（纯度≥91.3%）、异槲皮苷（纯度≥99.0%）和山柰酚（纯度≥98.0%）均购自上海诗丹德标准技术服务有限公司。绿原酸（纯度≥96.1%）、芦丁（纯度≥91.6%）和水仙苷（纯度≥93.1%）均购自中国食品药品检定研究院。

1.2 试验方法

1.2.1 样品制备。

1.2.1.1 茄尼醇的供试品制备方法。取样品0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中。精密加入甲醇20 mL，称定重量，超声处理（功率300 W，频率40 kHz）30 min。取出，放冷，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，即得。

1.2.1.2 酚酸及黄酮类化合物供试品制备方法。取样品0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中。精密加入50%甲醇20 mL，称定重量，超声处理（功率300 W，频率40 kHz）15 min。取出，放冷，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，即得。

1.2.2 仪器分析。

1.2.2.1 使用HPLC测定茄尼醇。色谱柱Agilent Poroshell 120 EC-C18 （4.6×150 mm，2.7 μm）；进样量5 μL；检测波长210 nm；流动相比例甲醇∶乙醇（35∶65）；流速0.8 mL/min。

1.2.2.2 使用UPLC-QqQ-MS测定酚酸和黄酮。色谱柱：Agilent Poroshell 120 EC-C18 （4.6×150 mm，2.7 μm）；柱温30 ℃；进样量1 μL；流速0.8 mL/min；流动相：A相乙腈溶液，B相0.1%甲酸水溶液。

1.2.2.3 质谱检测模式。多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）模式；离子源参数：气帘气10 psi，离子源雾化气50 psi，离子源加热辅助气50 psi，驻留时间100 ms，喷雾毛细管电压5 500 V，离子源温度500 °C。

1.3 数据处理与分析 采用Excel 2013对数据进行统计分析与作图。

2 结果与分析

2.1 预处理方式对茄尼醇含量的影响

试验样品中茄尼醇的含量见表2。由表2可知，在新鲜未经预处理的条件下，对于烟田废弃物，烟杈烟花及烟秆中的茄尼醇含量低于0.01%，底脚叶中的茄尼醇含量为0.020%；对于正常使用的烟叶，上部叶、中部叶、下部叶中的茄尼醇含量分别为0.684%、0.495%和0.757%，均高于烟田废弃物中的含量。

对比不同预处理方式样品中的茄尼醇含量（图1），结果表明：杀青处理能显著提升底脚叶中的茄尼醇含量，龙岩和

三明底脚叶杀青样品茄尼醇含量升高至0.4%以上，是新鲜未经预处理样品的24倍。对于下部叶和中部叶，杀青和烘烤样品中茄尼醇含量较冷冻鲜烟叶稍有下降，龙岩、三明两地烟叶差异不大。对于上部叶，杀青和烘烤样品中茄尼醇含量较冷冻鲜烟叶稍有上升，且龙岩烟叶中的含量高于三明。

2.2 预处理方式对酚酸及黄酮含量的影响

试验样品中酚酸及黄酮的含量见表3。结果表明，绿原酸和芦丁分别是酚酸类化合物和黄酮类化合物中含量较高的代表。在新鲜未经预处理的条件下，对于烟田废弃物，烟杈烟花、烟秆和底脚叶中的绿原酸含量低于0.02%，底脚叶和烟秆中的芦丁含量低于0.03%，烟杈烟花中的芦丁含量较高达0.040 1%。对于正常使用的烟叶，上部叶、中部叶、下部叶中的绿原酸含量为0.017 8%～0.022 1%，部位间差异不大；上部叶、中部叶、下部叶中的芦丁含量为0.118 2%～0.217 0%，上部叶中的芦丁含量低于中部叶和下部叶。

对比了不同预处理方式样品中的绿原酸含量（图2）。结果表明，除烟杈烟花外，杀青、烘烤处理可明显提高样品中绿原酸含量，且烘烤样品的提升幅度更明显。此外，三明烘烤烟叶样品中的绿原酸含量明显高于龙岩。

对比了不同预处理方式样品中的芦丁含量（图3）。结果表明，与绿原酸含量的变化规律类似，烟叶类样品杀青、烘烤处理可明显提高样品中芦丁含量，且烘烤样品的提升幅度更明显。而烟秆杀青后芦丁含量变化不明显，烟杈烟花杀青后芦丁含量则稍有下降。此外，龙岩杀青烟叶样品中的芦丁含量稍高于三明。

3 讨论

茄尼醇在烟叶及烟草制品中广泛存在，可以用于合成辅酶Q10、维生素K2等高价值产物，且具有抗菌、抗炎等生物活性［4］。孙楠等［7］

利用溶剂提取了陕西省商洛市废次烟叶中的茄尼醇，所得产率为0.10%。张露［8］优化了微波辅助提取废弃烟叶中茄尼醇的方法，在最适条件下得率为0.581%。绿原酸是烟叶中含量最高的酚酸类物质之一，具有抗氧化、抗菌、抗病毒等多种生理作用［9］。许诗豪等［10］采用乙醇加热回流的方法同时提取烟叶中的绿原酸与芦丁（芸香苷），2种物质的合计产量为43.17 mg/g（4.32%）。卫佳［11］运用50%乙醇浸提废次烟叶，绿原酸产率为0.714%。芦丁（芸香苷）是一种天然的黄酮苷及抗氧化剂［12］。李海洋等［2］优化了废弃烟叶中芦丁的超声波提取试验条件，得率达到13.7 mg/g（1.37%）。以上研究报道的生物活性物质提取得率与该研究相近。为了进一步提高目标物质在溶剂中的释放，可以尝试采用酶解等方式破坏烟叶组织的细胞壁。例如，黄振瑞等［13］基于纤维素酶-半纤维素酶联用的方法对烟叶进行预处理，经响应面法优化后总茄尼醇提取率较空白组提高了158.78%。陈月星等［14］结合纤维素酶和无水乙醇联合提取废次烟叶中的绿原酸，提取率为25.863 mg/g（2.59%）。