韭菜珠芽高效离体再生体系的建立

摘要 以田间发现的韭菜植株花托上部特异性芽体（称其为珠芽）为外植体，对其进行组织培养，通过对不同激素配比的研究，建立韭菜珠芽的再生体系。结果表明，使用10%次氯酸钠溶液消毒7 min，消毒效果最佳，无菌率可达82.32%，MS+1.5 mg/L 6-BA+0.4 mg/L 2，4-D为最佳不定芽诱导培养基，其不定芽诱导率为78.52%，MS+2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA为最佳不定芽伸长培养基，不定芽伸长率可达86.63%，1/2MS+0.5 mg/L IBA为最佳生根培养基，生根频率为88.20%，其移栽成活率可达95%以上。

关键词 韭菜；特异性芽体；珠芽；组织培养

中图分类号 S 633.3  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2024）24-0042-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.24.010

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Establishment of an Efficient in vitro Regeneration System of Bulbel of Chinese chive

ZHANG Zi-juan，WANG Chang-hao，ZHANG Gui-hai  et al

（Langfang Academy of Agricultural and Forestry Sciences，Langfang，Hebei 065000）

Abstract In this study，the specific bud on the upper part of the receptacle of Chinese chive plant （called bulbil） found in the field was used as the explant for tissue culture.Through the study of different hormone ratio，the regeneration system of Chinese chive bulbil was established.The results showed that using 10% sodium hypochlorite solution for 7 min had the best disinfection effect and the sterility rate was 82.32%，MS+1.5 mg/L 6-BA+0.4 mg/L 2，4-D was the best medium for adventitious bud induction，and the adventitious bud induction rate was 78.52%. MS+2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA was the best medium for adventitious bud elongation，and the elongation of adventitious bud reached 86.63%，and 1/2MS+0.5 mg/L IBA was the best rooting medium，the rooting frequency was 88.20%， the survival rate of transplanting was more than 95%.

Key words Chinese chive;Specific bud;Bulbil;Tissue culture

韭菜，又名草钟乳、起阳草，为百合科葱属多年生宿根草本植物，原产于中国，在我国已有3 000多年的栽培历史^［1］。韭菜的叶片、花葶、假茎、花均可食用，其以独特的辛辣味、丰富的营养物质、较多的粗纤维而深受消费者喜爱^［2-3］。我国是韭菜种植生产大国，目前韭菜育种方式多为常规育种，如杂交育种、优势育种等，育种周期较长，所需人力物力相对较多^［4］。相对于传统的育种方式，将组织培养技术与育种技术相结合，利用韭菜器官组织培养获得再生植株，对于种质材料的保存、拯救濒危资源、缩短育种年限、提高育种效率都有积极意义^［5-6］。在韭菜组织培养研究中，有以韭菜根尖^［7］、叶片^［8］、花托^［9-10］等器官为外植体的相关研究，而笔者以田间偶然发现的韭菜植株花托上部特异性芽体（称其为珠芽）为外植体，其外观为紫红色、形态饱满，以这种田间发现的材料为外植体，旨在探究出一套适合其组织培养的快速繁殖体系，为以后田间发现的变异株、特异株进行留种、保种、育种提供一种可行的方法。

1 材料与方法

1.1 基本培养基

选用MS（全配）培养基，pH调至5.8；所有培养基经120 ℃灭菌20 min，植物激素经过滤灭菌后添加到受试培养基。接种后均放到培养间中进行组织培养。

1.2 试验材料

供试材料来源于河北省廊坊市农林科学院蔬菜研究所，韭菜品种为蔬菜研究所培育的PX系列。试验材料为试验基地田间偶然发现的、花盘上长出的特异性芽体。于晴天上午对长势健壮、无病害的韭菜植株进行取材。

1.3 试验方法

1.3.1 无菌外植体的获得。

将花托基部顺着珠芽长势将其逐一分开，用手术刀片将其表面刮干净。先于自来水下冲洗1～2 h，再在超净工作台上，用75%乙醇消毒4～5 min，然后采用以下不同消毒处理：10%次氯酸钠溶液消毒3 min（A）；10%次氯酸钠溶液消毒5 min（B）；10%次氯酸钠溶液消毒7 min（C）；10%次氯酸钠溶液消毒9 min（D）。10%次氯酸钠溶液消毒后均用无菌水冲洗4～6次，再用无菌滤纸吸干珠芽表面水分，将消毒后萎蔫的苞片剥去，切去基部变腐部位，将剩余材料进行接种。7～14 d后，统计外植体的无菌率。

1.3.2 不定芽诱导。

将确认无菌的珠芽，接种至附含不同浓度6-BA（1.0、1.5、2.0 mg/L）和2，4-D（0.2、0.4、0.6 mg/L）的MS培养基中进行不定芽诱导。21～28 d后统计不定芽诱导率。

1.3.3

不定芽伸长。将经不定芽诱导后的材料接种至不定芽伸长培养基中，使其伸长到一定高度，便于后期生根与移栽。以不同浓度的6-BA和NAA进行不定芽伸长研究，以确定不定芽有效伸长的最佳配方。

将诱导出的不定芽转接至附含不同浓度6-BA（1.0、1.5、2.0 mg/L）和NAA（0.5、1.0、1.5 mg/L）组合的MS培养基上。10～15 d后统计不定芽伸长率。

1.3.4 不定根诱导。

选取长势健壮的试管苗（3.0～4.0 cm），通过MS（A）、1/2MS（B）、1/2MS+0.5 mg/L IBA（C）进行不定根诱导，15 d后开始统计每种方法的生根情况，25 d后统计生根率，探索出生根频率较高的方法。

1.3.5 炼苗与移栽。

当试管苗的根长至4.0～5.0 cm时，去掉组培瓶瓶盖，倒入少量无菌水，炼苗3～4 d后将试管苗移栽到棚室中进行栽培，观察生长情况。

1.4 数据统计

无菌率=无菌外植体数/接种数×100%

不定芽诱导率=诱导出不定芽的外植体数/接种数×100%

不定芽伸长率=伸长的不定芽数/接种数×100%

生根率=生出根系的幼苗数/接种数×100%

2 结果与分析

2.1 无菌外植体的获得

设置4种不同消毒方式进行消毒，以探究珠芽最佳消毒方式。由图1可知，使用10%次氯酸钠溶液消毒3 min的方法A珠芽无菌率较低，为16.98%，珠芽表面状态较好。此方法中，虽然次氯酸钠溶液对芽体伤害较小，但无法获得有效的无菌外植体。使用10%次氯酸钠溶液消毒5 min的方法B，其消毒效果相对于方法A，无菌率有所提升，珠芽表面苞皮软化。使用10%次氯酸钠溶液消毒

7 min的方法C消毒效果最佳，无菌率达82.32%，芽体变软，将表面苞皮去除后，里面部分仍保留完好（图2C）。使用10%次氯酸钠溶液消毒9 min的方法D消毒效果最差，芽体腐烂程度较严重，即使去除苞皮后，可用材料较少。因此，使用10%次氯酸钠溶液消毒7 min，消毒效果最佳，为珠芽的最佳消毒方式。

2.2 不定芽诱导

将获得的无菌外植体，进一步转接至不定芽诱导培养基中，以提高诱导率。将植物激素6-BA与2，4-D结合，可使外植体在诱导不定芽的同时，芽体基部与培养基接触部位也伴随着愈伤的形成，在愈伤组织上会长出较多的不定芽，可提高诱导效率（图2D、E）。由表1可知，当6-BA浓度为1.0 mg/L时，不定芽诱导率随着2，4-D浓度升高而升高，整体不定芽诱导效果欠佳，基部愈伤组织较少；当6-BA浓度为1.5 mg/L时，不定芽诱导率随着2，4-D浓度升高先升高后降低，不定芽诱导率在2，4-D浓度为0.4 mg/L时达到最大，为78.52%，高于2，4-D 0.6 mg/L时的不定芽诱导率（74.24%），诱导出的不定芽翠绿，基部愈伤组织致密，芽点较多；当6-BA浓度为2.0 mg/L时，不定芽诱导率随着2，4-D浓度升高而呈降低趋势，不定芽较少，基部愈伤组织较疏松，有些呈水渍状，芽点较少。因此，MS+1.5 mg/L 6-BA+0.4 mg/L 2，4-D条件下诱导不定芽效果最好，其不定芽诱导率为78.52%。

2.3 不定芽伸长

将上述诱导出的长至1～2 cm的不定芽转入不定芽伸长培养基中，进行伸长培养。结果发现，若将长出的不定芽切下，直接插入不定芽伸长培养基中，不定芽会变软、变黄，直至枯萎；若将诱导出的不定芽连同基部愈伤组织一同转入伸长培养基中，叶片伸长效果较好，颜色翠绿，生长旺盛（图2F）。

将6-BA与NAA结合，可有效促进韭菜不定芽的伸长。由表2可知，当6-BA浓度为1.0与1.5 mg/L时，随着NAA浓度的升高，不定芽伸长率呈升高趋势；当6-BA浓度为2.0 mg/L时，随着NAA浓度的升高，不定芽伸长率呈下降趋势，但整体伸长率仍较高，伸长的叶片长势也较好，在6-BA浓度为2.0 mg/L、NAA浓度为0.5 mg/L时，不定芽伸长率最高，可达86.63%，不定芽长势较健壮，伸长的叶片形态宽，颜色深绿，长势良好。在6-BA浓度为2.0 mg/L和NAA浓度为1.5 mg/L时，2种激素浓度均较高的情况下，虽然不定芽伸长率仍较高，但部分组培苗叶片会发生矮化现象，在基部

呈螺旋状生长，与市场对韭菜直立性的要求不符。因此，不定芽伸长的最佳培养基配方为MS+2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA。

2.4 不定根诱导

为了探究韭菜组培苗的最佳生根方法，设计了3种不同的生根方式。将长至3.0～4.0 cm的组培苗转接至不定根诱导培养基中，13 d后，基部有乳白色点状凸起，30 d时可见大部分组培苗均生根（图3A、B）。由表3可知，采用不加任何植物激素的MS（全配）培养基的方法A，生根频率最低，生根启动最慢，长出的根较细、白。采用不加任何植物激素的1/2 MS（全配）培养基的方法B，生根频率大幅提高，为84.77%。采用1/2 MS（全配）培养基，并添加0.5 mg/L IBA的方法C，生根频率有所提高，为88.20%，虽然方法C与方法B中的生根频率相差较小，但生根启动时间明显缩短，且根长势健壮，有利于提高后期的移栽存活率。因此，不定根诱导的最佳方法为C，即1/2MS+0.5 mg/L IBA。在生产中采用方法B或者方法C 2种生根方式均可，方法C虽然启动天数较短，但方法B操作简单，免去了添加植物激素的步骤，可根据实际所需进行选择。