羊肉中貉源成分Real-time PCR检测方法的建立

摘要 ［目的］检测羊肉中是否含有貉肉成分。［方法］通过实时荧光定量PCR方法，以cytB为靶基因设计特异性检测引物，选取8个不同物种的肌肉组织样本为研究对象，根据其ΔCt值函数关系进行线性拟合建立标准曲线。［结果］该检测方法所用引物能将貉与其他物种区分，特异性较强，且最低检测限可达到3.2 pg/μL，回收率在97.71%～104.36%，组内变异系数≤0.28%，组间变异系数≤1.08%。［结论］该研究建立的羊肉中貉肉源成分实时荧光定量检测方法具有良好的特异性和敏感性，可用该方法检测实际羊肉样品中是否有貉肉源成分，为羊肉制品掺假的检测提供简单快捷准确的技术手段和执法依据。

关键词 羊肉；貉肉；Real-time PCR；掺假肉

中图分类号 TS 251.7  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2023）01-0179-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.01.040

Establishment of a Real-Time PCR Method for Detecting Raccoon Dog in Mutton

ZHANG Yi1，TANG Si-ning1，MEI Ru-fan2 et al

（1.Tangshan Food and Drug Comprehensive Inspection and Testing Center，Tangshan，Hebei 063000;2.College of Animal Science and Technology，Hebei Normal University of Science and Technology，Qinhuangdao，Hebei 066000）

Abstract ［Objective］To detect whether raccoon dog meat components are contained in mutton.［Method］We designed specific detection primers using cytB as a target gene by real-time PCR，selected muscle tissue samples from eight different species as study subjects，and established a standard curve by linear fitting according to their ΔCt value function relationship.［Result］The primers used in this detection method could distinguish raccoon from other species，with specificity，the lowest detection limit could reach 3.2 pg/μL，the recovery rate was 97.71%-104.36%，the intraclass coefficient of variation was ≤ 0.28%，and the coefficient of variation was ≤ 1.08%.［Conclusion］The real-time fluorescence quantitative detection method system for raccoon dog meat components in mutton established in this study has good specificity and sensitivity，and this method can be used to detect whether there are raccoon dog meat components in actual mutton samples，providing a simple，rapid and accurate technical means and law enforcement basis for the detection of adulteration of mutton products.

Key words Mutton;Raccoon dog meat;Real-time PCR;Adulterated meat

基金项目 河北省高端人才项目；唐山市科技创新领军人才项目（21130243A）。

作者简介 张谊（1981—），男，河北唐山人，畜牧师，从事畜产品质量安全研究。通信作者，教授，硕士生导师，从事农产品质量安全检验研究。

收稿日期 2022-02-25

我国是羊肉产量大国，羊肉消费呈逐年增长的趋势，但掺假问题一直是影响羊肉消费的关键问题，尤其是动物源性食品掺假是最常见也是最难鉴别的严重问题［1-2］。我国毛皮经济动物貉子养殖量大，每年会产出大量的貉子废弃肉，貉子胴体有可能成为羊肉掺假中一类。截至目前，已经开发了许多肉类掺假检测的检测技术，包括Real-time PCR（qPCR）检测技术、近红外特征光谱技术、高光谱法、分光光度法和酶联免疫分析法等［3-12］。这些检测方法中，Real-time PCR特异性更强、灵敏度更高、成本更低，该方法在肉类掺假方面的应用已日趋成熟［13-18］。该研究利用Real-time PCR，建立一种对貉肉源成分的快速检测方法，以期对羊肉及其肉制品中貉肉源的掺假进行定性及定量的检测，为量化羊肉成分研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

猪肉、牛肉、鸡肉、鸭肉购自秦皇岛某大型超市；羊肉、貉肉、狐狸肉、貂肉由河北省预防兽医重点实验室提供；吸附柱法动物组织基因组DNA提取试剂盒、磁珠法动物组织基因组DNA提取试剂盒购自北京天根科技有限公司；琼脂糖、DL2000 DNA Marker、2×ES Taq MasterMix（Dye）均购自北京索莱宝科技有限公司。

1.2 仪器与设备

NanoDrop 2000核酸蛋白定量仪（美国Thermo Scientific公司）；DYY-6D型电泳仪（北京市六一仪器厂）；高速离心机 FC5515R（上海京工实业有限公司）；台式高速离心机 TGL-16G（上海安亭科学仪器厂）；Mx3000P Agilent（美国安捷伦Stratagene公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 样品的制备。

分别取猪、牛、羊、鸡、鸭、狐狸、貉、貂8种动物的鲜肉组织样本各1 g，放在高压灭菌处理过的研钵中进行液氮研磨，研成肉末后转移至冻存管中，于-80 ℃保存备用。

1.3.2 基因组DNA的提取。

分别称取100 mg 8种动物组织肉末，按组织基因组DNA提取试剂盒操作说明提取DNA，-20 ℃保存备用。

1.3.3 DNA浓度纯度检测。

用NanoDrop 2000核酸蛋白定量仪测定核酸浓度与纯度，记录A260/A280及A260/A230值；并将DNA进行2%琼脂糖凝胶电泳，以检测其完整性。

1.3.4 PCR引物设计。

参考相关文献［19-23］，根据貉子线粒体cytB基因序列，并使用NCBI Blast、MEGA 7等软件将貉源cytB基因与猪、牛、羊、鸡、鸭、狐狸、貂物种序列进行比对，筛选不同种物种间差异序列，设计特异性引物。选择较为保守的基因16S rDNA为内参基因，设计通用引物。引物序列如表1所示。

1.3.5 实时荧光 PCR反应条件的建立与优化。

实时荧光PCR反应体系（20 μL）：上游引物（10 μmol/L）0.4 μL，下游引物（10 μmol/L）0.4 μL，2×Perfect StartTM Green qPCR SuperMix 10.0 μL，Nuclease-free Water 8.2 μL，模板DNA 1.0 μL。预试验中在46～54 ℃设置了梯度PCR，最后确定了50 ℃为退火温度，其扩增效果最佳。PCR反应条件：94 ℃预变性30 s，94 ℃变性5 s，50 ℃退火15 s，72 ℃延伸10 s，共40个循环。

1.3.6 特异性引物和通用性引物检测。

将提取8个物种基因组DNA进行稀释，浓度均为50 ng/μL，分别使用特异性引物cytB及通用引物16S rDNA进行qPCR扩增，ddH2O为阴性对照。根据所得曲线图及Ct值分析cytB引物的特异性和16S引物通用性。

1.3.7 引物灵敏度检测。

将初始浓度为50 ng/μL的貉DNA样本进行5倍梯度稀释，使其终浓度分别为50.0 ng/μL、10.0 ng/μL、2.0 ng/μL、400.0 pg/μL、80.0 pg/μL、16.0 pg/μL、3.2 pg/μL，分别以其为模板进行qPCR扩增，ddH2O为阴性对照。根据曲线图及Ct值分析特异性cytB引物所能扩增的最低检测浓度。

1.3.8 定量标准曲线建立。

按照总质量为100 mg，貉肉含量分别为0、10%、30%、50%、70%、90%和100%的比例与羊肉混合，混合肉样提取DNA后，统一稀释初始浓度为50.0 ng/μL，进行qPCR扩增。每个样品做3个重复，结果以±S 表示，采用相对定量法建立标准曲线。

1.3.9 标准曲线准确性验证。

以总质量为100 mg，貉肉含量分别为5%、15%、45%、65%和95%的貉羊混合肉进行DNA提取后，统一稀释为50.0 ng/μL，进行qPCR扩增。将ΔCt值带入已建立的定量标准曲线，计算羊肉质量百分比及其回收率，16S rDNA作为内参，每个样品做3个重复，检验标准曲线的准确性。

1.3.10 检测方法的稳定性评估。

取终浓度分别为400.0、80.0、3.2 pg/μL的貉DNA样本，以其为模板进行qPCR扩增，分别进行组内及组间重复性试验。每个浓度重复检测3次，记录各浓度在检测体系的Ct值，并计算其变异系数，以评估检测方法的稳定性和重复性。

2 结果与分析

2.1 DNA浓度和纯度测定

不同肉类DNA浓度和纯度测定结果见表2。按核酸提取要求，无蛋白质污染的核酸溶液A260/A280＞1.8，无碳水化合物污染的核酸溶液A260/A230＞2.0。测定结果（表2）显示，提取的各类肉DNA纯度和浓度均达到要求，模板DNA质量较好，无蛋白及杂质污染，可用于后续qPCR检测。

不同肉类基因组DNA电泳检测结果如图1所示。电泳条带清晰、完整，说明提取的基因组DNA可用于后续qPCR检测。

2.2 引物cytB特异性及16S通用性检测结果

以cytB作为特异性引物，分别以猪、牛、羊、鸡、鸭、貉、狐狸和貂基因组DNA为模板进行qPCR扩增。如图2所示，8种畜禽肉中，只有貉肉DNA在第17个循环处开始进入指数扩增期，而其余6种在第27个循环处才开始进入指数扩增期，可以很好地与其他几个常见物种区分，表明cytB引物特异性较强，符合试验要求。

内参引物16S对8种畜禽肉均有较好的扩增效率，且内参基因16S rDNA 检测的Ct值均集中在狭窄范围内，较为稳定（图3），表明其具有通用性。