一种新型拟除虫菊酯类农药半抗原的设计合成及其效果评价

摘要 基于菊酯类农药特殊结构及现有合成菊酯半抗原的种种问题，设计一种新型合成拟除虫菊酯半抗原方法。该方法以菊酯类原药为原料，经臭氧氧化、卤代反应、维悌希反应、水解4步化学反应合成半抗原。采用该方法合成了氯氰菊酯、氯菊酯、氟氯氰菊酯、溴氰菊酯半抗原，这些半抗原分别与牛血清蛋白和卵清蛋白偶联，获得免疫抗原和包被抗原。用这4种免疫抗原分别免疫BALB/C小鼠，制备多克隆抗血清。采用免疫分析方法对这4种多克隆抗血清的性能进行测试，该抗血清的效价都较高，达到15 000倍以上；用1 mg/L拟除虫菊酯原药进行竞争试验，除溴氰菊酯外其余抑制率均可达到50%以上。说明设计的半抗原结构和合成方法可行，为后续进一步研究提供参考。

关键词 拟除虫菊酯类农药；半抗原；合成；免疫分析

中图分类号 TS 207.3  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2023）01-0188-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.01.042

Design and Synthesis of a New Pyrethroid Pesticide Hapten and Its Effect Evaluation

YANG Xing-xing， FU Hui， WANG Bing-zhi et al

（Shenzhen Bioeasy Biotechnology Co.， Ltd.， Shenzhen，Guangdong 518101）

Abstract Based on the special structure of pyrethroid pesticides and various problems in the synthesis of pyrethroid hapten， a new method for the synthesis of pyrethroid hapten was designed. The haptens were synthesized by using pyrethroids as raw materials through four chemical reactions： ozone oxidation， halogenation， wittig reaction and hydrolysis. Using this method， we synthesized cypermethrin， cypermethrin， cyhalothrin and deltamethrin haptens. These haptens were coupled with bovine serum protein and ovalbumin to obtain immune antigens and coating antigens. BALB/c mice were immunized with these four immune antigens to prepare polyclonal antiserum. The performance of the four polyclonal antisera were tested by immunoassay. The titers of the antisera were high， up to more than 15 000. In the competitive test with 1 mg/L pyrethroid， the inhibition rates were more than 50% except deltamethrin.It was indicating that the designed haptens structure and synthesis methods were feasible， which provided a reference for further research.

Key words Pyrethroid pesticide;Hapten;Synthesis;Immunoassay

基金项目 广东省科技厅项目（2021A0505080003）；国家重点研发计划项目（2019YFC1605500）；上海市科技兴农项目（2019-02-08-00-15-F01147）。

作者简介 杨星星（1985—），男，湖北随州人，高级工程师，硕士，从事食品安全快速检测研究。

通信作者，高级工程师，从事食品安全快速检测研究。

收稿日期 2022-02-12；修回日期 2022-03-24

拟除虫菊酯类农药由于其高效低毒被广泛用于蔬菜、水果、农作物、林业的害虫防治。然而，随着拟除虫菊酯类农药长期大量的使用，其原药本体及代谢物残留危害日益明显，现已引起世界各国研究者的极大关注［1-2］。

目前，检测拟除虫菊酯残留最常用的方法是气相色谱法，此外，高效液相色谱法、毛细管电泳法、质谱-色谱联用技术等［3-11］也都可用于拟除虫菊酯残留的检测，但这些仪器分析法对样品基质要求高，往往需要复杂的前处理，不仅耗时费钱，而且会造成痕量拟除虫菊酯的损失；再加上这些仪器分析方法无法满足低成本、高通量、快速检测和现场检测的要求。免疫分析法由于前处理简单、使用方便等优点正好可以弥补这些不足，因此建立拟除虫菊酯的免疫检测技术具有很好的发展前景和市场潜力。

建立拟除虫菊酯免疫检测方法的关键是制备亲和力强和高灵敏度的抗体，而重点在于半抗原的设计合成。一直以来，由于对抗原抗体作用机理以及半抗原空间结构的了解不足，导致半抗原设计具有很大的盲目性，通常需要反复多次的试错尝试，耗费了大量的资金和时间。而且对于非有机合成专业的人员来说，对目标物进行有机修饰或从头合成半抗原，往往非常困难。另外，拟除虫菊酯是一类典型的手性农药，含有多个旋光异构单体，这对于能够识别手性单体的抗体而言，一种菊酯往往是多种物质的混合物，增大了免疫分析的难度。目前针对拟除虫菊酯半抗原的合成主要有全合成在苯环上衍生手臂［12-14］、在菊酯的氰基上衍生手臂，这些方法制备的半抗原手性结构会有很多种，而对半抗原进行手性分离又是非常困难的事；有的甚至只使用菊酯的部分结构［15-16］，导致免疫获得的抗血清竞争不理想。为了能够有效地获得高质量拟除虫菊酯的抗体，笔者经过多次尝试成功运用拟除虫菊酯原药为原料，在不改变菊酯整体结构情况下，经过几步简单的合成，制备出与原药手性结构一样的农药半抗原单体；并对几种拟除虫菊酯的抗血清进行性能测试，能够满足一定的要求，为后续进一步研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 主要试剂。

氯氰菊酯、氯菊酯、氟氯氰菊酯、溴氰菊酯原药购自成都温江试剂；二甲硫醚、三苯基磷乙酸叔丁酯、无水四氢呋喃、三氟乙酸、N，N-二甲基甲酰胺（DMF）、1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）、液溴购于上海安耐吉试剂公司；卵清蛋白（Ovalbumin，OVA）、牛血清蛋白（Bovine serum albumin，BSA）、弗氏佐剂购自美国Sigma 公司；羊抗小鼠IgG-HRP购自北京Solarbio生物有限公司；拟除虫菊酯类农药标准品购自北京坛墨质检；包被液、稀释液、洗涤液、封闭液、TMB 底物溶液、终止液均参考文献［17］配制。

1.1.2 实验动物。

Balb/c小鼠，雌性，8～9周龄，体重 20～22 g（广东省医学动物实验中心）。

1.1.3 仪器。

DHJF-8002 低温恒温搅拌反应浴（郑州长城科工贸有限公司）；旋转蒸发仪（日本爱朗公司）；酶标板自动洗涤机（美国，Bio-tech）；API 3000液质联用仪（美国，AB）；酶标仪（美国，Thermo）；臭氧发生器（广州奥普发环保科技有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 半抗原的合成。

称取10 mmol拟除虫菊酯原药（氯氰菊酯、氯菊酯、氟氯氰菊酯、溴氰菊酯），用30 mL二氯甲烷溶解后转移至冷阱中，在-78 ℃下通入预干燥并预冷却的臭氧6 h（臭氧通过臭氧发生器制备，产气量为20 g/h）。反应完成后通入预干燥并预冷却的氮气15 min，再加入70 mmol二甲硫醚，-78 ℃通入氮气鼓泡反应30 min后取出，蒸干溶剂，过柱纯化得无色油状物JZ-1。

将12 mmol三苯基磷乙酸叔丁酯溶于30 mL二氯甲烷，在冰水浴下通入氯气直到体系变黄绿，停止氯气（注：若是制备溴氰菊酯半抗原则是直接加入液溴），继续搅拌过夜，反应完成后旋干后无需后处理直接用，即得到JZ-2。

取4.0 mmol JZ-1再加入6.0 mmol JZ-2，用无水四氢呋喃20 mL与二氯甲烷3 mL溶解。室温搅拌反应4 h，反应完成后加适量水用乙酸乙酯萃取2～3遍，合并有机相，蒸干后过柱纯化，得到无色油状物JZ-3。

称取1.5 mmol  JZ-3溶于6 mL二氯甲烷，再加入3 mL三氟乙酸，室温搅拌反应1 h，反应完成后旋蒸除去溶剂，加乙酸乙酯30 mL，用柠檬酸-柠檬酸钠饱和溶液洗涤2次，再用水洗涤2次，最后用饱和食盐水洗涤1次，有机相干燥后旋干，得白色固体即菊酯半抗原，分别编号为JZ-H1、JZ-H2、JZ-H3、JZ-H4，具体合成路线和结构见图1和表1。

1.2.2 人工抗原的合成。

采用活泼酯法将合成的拟除虫菊酯半抗原JZ-H1、JZ-H2、JZ-H3、JZ-H4分别与载体蛋白BSA 相偶联，制备菊酯人工免疫抗原。具体步骤：称取1 mmol半抗原、1.1 mmol N-羟基琥珀酰亚胺、1.2 mmol 1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐，加入0.5 mL DMF溶解，在磁力搅拌下室内温度进行反应8 h。反应结束后吸取0.2 mL，缓慢滴加到3 mL 10 mg/mL 的 BSA 碳酸盐缓冲液（pH 9.6）/DMF（2∶1，v/v）混合液中，在磁力搅拌下室温反应6 h。将反应液置于透析袋内，在0.01 mol/L pH 7.4的 PBS 溶液中搅拌透析，每 4～8 h 换1 次透析液，共透析72 h。透析结束后将透析袋中的蛋白溶液分成若干等份分装于 1 mL 离心管中，分别编号JZ-H1-BSA、JZ-H2-BSA、JZ-H3-BSA、JZ-H4-BSA，于-20 ℃冰箱中存放备用。

采用混合酸酐法制备包被原，具体步骤：将1 mmol菊酯半抗原溶于 0.5 mL DMF，冰浴下，加入1.2 mmol三丁胺、1.2 mmol氯甲酸异丁酯，室温避光搅拌反应 60 min，得到的混合酸酐溶液缓慢滴加到3 mL 20 mg/mL 的 OVA PBS（0.01 mol/L，pH 7.4）/DMF（2∶1，v/v）混合液中，室温磁力搅拌反应 3 h，将反应液置于透析袋内，在0.01 mol/L pH 7.4的 PBS 溶液中搅拌透析，每 4～8 h 换1 次透析液，共透析72 h。透析结束后将透析袋中的蛋白溶液分成若干等份分装于 1 mL 离心管中，分别编号JZ-H1-OVA、JZ-H2-OVA、JZ-H3-OVA、JZ-H4-OVA，于-20 ℃冰箱中存放备用。

1.2.3 抗血清制备。

选取12 只8 周龄的 Balb/c 雌性小鼠分为4组，每组（编号分别为 1 号、2 号、3 号小鼠）首先是尾部采血取血清作为阴性血清，之后进行免疫，免疫4次，每次免疫间隔21 d，第4次免疫后7 d，挖眼采集血清100 μL，冰箱过夜，10 000 r/min离心 10 min，得到菊酯鼠多抗血清。

1.2.4 抗血清效价和灵敏度测定。

将包被原JZ-H1-OVA、JZ-H2-OVA、JZ-H3-OVA、JZ-H4-OVA用碳酸缓冲液稀释至所需浓度包被后，抗血清效价的测定采用间接非竞争 ELISA 操作程序，抗血清灵敏度的测定采用间接竞争ELISA 操作程序，具体程序参照文献［18］ 。

2 结果与分析

2.1 半抗原的鉴定

将“1.2.1”合成的4种拟除虫菊酯半抗原JZ-H1、JZ-H2、JZ-H3、JZ-H4采用质谱进行测定，检测在负离子模式下进行，如图2所示。从图2可以看出，这些半抗原均可得到分子离子峰 ［M-H］-以及倍峰 ［2M-H］-；JZ-H1分子离子峰 424.4［M-H］-，倍峰849.5 ［2M-H］-；JZ-H2分子离子峰 399.4［M-H］-，倍峰799.7［2M-H］-；JZ-H3分子离子峰 442.6［M-H］-，倍峰885.5［2M-H］-；JZ-H4分子离子峰470.6［M-H］-，倍峰939.6 ［2M-H］-；这些峰均与其对应化合物的分子量相符（表1），说明这些半抗原合成成功。