丹江口库区土著Pediococcus pentosaceus菌株的分离鉴定及发酵培养基的优化

摘要 ［目的］筛选出具有自主知识产权、良好适应库区环境的土著戊糖片球菌菌株，再通过对戊糖片球菌的发酵培养基进行条件优化，降低戊糖片球菌的发酵成本。［方法］采用MRS培养基从库区的青贮饲料中分离目的菌株，并进行16S rRNA的分子鉴定，再分别对戊糖片球菌发酵培养基中的碳源种类、碳源浓度、氮源种类、氮源浓度、无机盐离子及离子浓度进行优化。［结果］获得了1株具有自主知识产权的土著Pediococcus pentosaceus菌株，命名为Pediococcus pentosaceus NY001；优化得到较适宜的发酵培养基为葡萄糖40  g/L、酵母粉40  g/L、MgSO4·7H2O 1.0  g/L，在此条件下，戊糖片球菌的最大发酵活菌数可达2.2×109 CFU/mL，显著高于初始发酵水平（2.5×107CFU/mL）的88倍。［结论］该研究为肠道益生菌的发酵培养及后续畜禽无抗健康养殖研究奠定了坚实基础。

关键词 戊糖片球菌；乳酸菌；菌种分离；培养基；发酵条件；优化

中图分类号 TQ 920.6  文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2023）02-0001-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.02.001

Isolation，Identification and Optimization of Culture Medium for Indigenous Pediococcus pentosaceus in Danjiangkou Reservoir Area

PAN Zhong-shan1，SHI Hong-ling2，LI Ying2 et al

（1.College of Food Science and Technology，Henan Agricultural University，Zhengzhou，Henan 450002;2.Collaborative Innovation Center of Water Security for Water Source Region of Mid-line of South-to-North Diversion Project of Henan Province，Nanyang Normal University，Nanyang，Henan 473061）

Abstract ［Objective］To screen out the indigenous strains of Pediococcus pentosaceus with independent intellectual property rights and good adaptation to the environment of the reservoir area，and then to reduce the fermentation cost of Pediococcus pentosaceus by optimizing the fermentation medium.［Method］The target strains were isolated from silage using MRS medium and identified by 16S rRNA.And the main components of the medium were optimized respectively，including carbon source，carbon source concentration，nitrogen source，nitrogen source concentration，inorganic ions and ion concentration.［Result］A Pediococcus pentosaceus strain with independent intellectual property rights was obtained and named as Pediococcus pentosaceus NY001.The more suitable medium for the fermentation of P.pentosaceus NY001 was glucose 40  g/L，yeast powder 40  g/L and MgSO4·7H2O 1.0  g/L，under the fermentation conditions，the maximum number of viable bacteria could reach 2.2×109 CFU/mL，which was about 88 times of the initial number of viable bacteria（2.5×107 CFU/mL）.［Conclusion］This study laid a solid foundation for the fermentation culture of intestinal probiotics and the subsequent research on the healthy breeding of livestock and poultry without anti bacteria.

Key words Pediococcus pentosaceus;Lactic acid bacteria;Strain isolation;Culture medium;Fermentation conditions;Optimization

基金项目

国家自然科学基金项目（31900916）；河南省青年人才托举工程项目（2021HYTP036）；南阳师范学院青年项目（2020QN003）；河南省高校科技创新人才（21HASTIT041）；河南省本科高校省级大学生创新创业训练计划项目（S202110481033）。

作者简介 潘中闪（1993—），女，河南南阳人，硕士研究生，研究方向：食品安全与质量。通信作者，副教授，博士，硕士生导师，从事食品免疫与营养学方面的研究。

收稿日期 2022-03-03；修回日期 2022-04-01

抗生素被用作饲料添加剂以来，在全球范围内得到了广泛的应用，但同时也带来了药物残留和耐药性等一系列严峻的社会问题［1-2］。大健康时代，健康产业的概念已经不再是依赖抗生素等药物的单一救治模式，而是从这种单一救治模式转向“防-治-养”一体化模式［3］，同时缓解因滥用抗生素对人类健康和生态环境造成的严重威胁［4］。在这种新型模式之下，益生菌与人体健康的关系已成为研究的热点［5］。

近年来，越来越多的证据表明，人体肠道内的微生物种群变化与人体健康的关系非常密切［6］，而益生菌在提升人体健康水平中扮演着举足轻重的角色。益生菌可通过维护肠道菌群的健康稳态，刺激宿主的免疫系统，增强宿主的免疫应答反应，从而帮助宿主抵抗各类疾病的发生［7］。益生菌是一类可以通过摄取适当的量、对食用者的身体健康能发挥有效作用的活菌［8］，在口腔疾病、肠道疾病、过敏性疾病等的预防、治疗和修复过程中发挥着重要作用［9-11］。

戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）广泛应用于食品工业领域，尤其是在益生菌剂及天然防腐剂等领域具有很广阔的应用前景［13-15］。目前戊糖片球菌多采用MRS培养基作为发酵培养基，但MRS发酵培养基成分复杂且价格昂贵。另外，菌种的自主知识产权也是制约我国益生菌产业快速发展的一个瓶颈。该研究从丹江口库区的青贮饲料中筛选一株具有知识产权、适应库区环境的土著戊糖片球菌，并在原始发酵培养基的基础上对碳源、氮源和无机盐离子分别进行成分及浓度的优化，以实现戊糖片球菌低成本、高密度的发酵生产，为丹江口库区的畜禽及水产的健康无抗养殖奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 主要试剂。

牛肉膏、酵母粉、葡萄糖、结晶乙酸钠、柠檬酸二铵、Tween 80、K2HPO4、MgSO4·7H2O、MnSO4·H2O、CaCO3，购自北京索莱宝科技有限公司；细菌DNA基因组提取试剂盒、2×TransStart FastPfu PCR SuperMix，购自北京全式金生物技术（TransGen Biotech） 股份有限公司；蛋白胨、琼脂、蔗糖和酵母粉，购自上海生工生物工程有限公司；淀粉、玉米粉、豆粕、麸皮，购自南阳市武侯路农贸市场；其他试剂均为国产分析纯。

1.1.2 培养基。

（1）MRS液体培养基。蛋白胨10 g/L、牛肉膏10 g/L、酵母粉5 g/L、葡萄糖5 g/L、结晶乙酸钠5 g/L、柠檬酸二铵2 g/L、Tween 80 1 g/L、K2HPO4 2 g/L、MgSO4·7H2O 0.2 g/L、MnSO4·H2O 0.05 g/L和CaCO3 2  g/L，用去离子水定容至1 L，121 ℃灭菌20 min，用于菌种活化。

（2）MRS固体培养基。在液体培养基的基础上添加15  g/L 琼脂粉。

（3）基础发酵培养基。葡萄糖20 g/L、蛋白胨10 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L和MnSO4·H2O 0.2 g/L，用去离子水定容至1 L，121 ℃灭菌20 min，用于种子液发酵。

1.1.3 主要仪器与设备。恒温摇床，购自上海智城分析仪器制造有限公司；UV1000紫外可见分光光度计，购自上海天美科学仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 菌种的分离及鉴定。称取1 g青贮饲料，将其置于99  mL 无菌水中，充分打散，定义稀释度为10-2，然后进行10倍梯度稀释，直到稀释度为10-6，取10-4、10-5和10-6这3个稀释度进行涂板，每个稀释度取0.1  mL涂布于MRS平板上，37 ℃厌氧培养48 h。挑取单菌落，在MRS平板上划线纯化。吸取部分液体用基因组提取试剂盒提取细菌基因组DNA。根据《伯杰细菌鉴定手册》，对目标菌株进行形态和生理生化特征鉴定。

利用细菌16S rRNA通用引物27F和1492R，以目的菌种基因组DNA为模板进行PCR扩增，1%的琼脂糖凝胶电泳。扩增后的PCR产物纯化后由上海生工生物工程有限公司测序，将测序结果提交到NCBI数据库并进行BLAST比对，下载相关序列，采用ClustalX 2.0软件进行同源性分析， Mega 6.0软件构建系统发育树。

1.2.2 种子液的培养。

挑取单菌落于5 mL MRS液体培养基中，37 ℃、200 r/min，振荡培养24 h。

1.2.3 生长曲线的测定。

以原始发酵培养基发酵种子液，37 ℃、200 r/min，振荡培养，每隔2 h取样，测定发酵液在600 nm 处的吸光度，绘制生长曲线。

1.2.4 种子液的发酵培养。

将活化后的种子液按体积分数5%转接至50 mL基础发酵培养基中，37 ℃、180 r/min，振荡培养18 h。

1.2.5 发酵液中活菌数的测定。

发酵液菌落形成单位（CFU）的测定采用稀释涂布法［16］。将稀释完的发酵液各吸取100 μL涂布于MRS固体平板，37 ℃恒温培养24 h。计数平板上形成的菌落，计算发酵液菌落形成单位数值（CFU/mL），该研究中以涂板时形成一个菌落定义为有一个活菌。