3种有机溶剂对普通小球藻生长特性的影响

摘要 ［目的］阐明藻类毒理学试验中使用有机溶剂可能对试验对象产生潜在毒性效应。［方法］以普通小球藻为研究对象，研究不同体积分数的3种有机溶剂（二甲基亚砜、乙醇、丙酮）对其生长速率、叶绿素a含量等生长特性的影响。［结果］当二甲基亚砜体积分数为0.01%～0.10%，普通小球藻藻密度与对照组相比无显著差异，当体积分数为0.50%～5.00%时，普通小球藻的生长显著抑制；当乙醇和丙酮体积分数为0.01%～2.00%时，普通小球藻的生长均表现出较明显的促进作用，当体积分数5.00%时，普通小球藻的抑制作用明显。在3种有机溶剂影响下，普通小球藻叶绿素a含量的变化趋势与藻密度、比生长速率表现出较好的一致性。［结论］该试验结果符合生态毒理学中的低促高抑规律，普通小球藻对乙醇和丙酮表现出更强的敏感性，建议在对普通小球藻相关毒理学试验中优先使用二甲基亚砜作为有机溶剂，且最大体积分数（NOEC）为0.10%。

关键词 二甲基亚砜；乙醇；丙酮；普通小球藻；藻密度；叶绿素a

中图分类号 X 592  文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2023）02-0075-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.02.019

Effects of Three Organic Solvents on the Growth Characteristics of Chlorella vulgis

ZHANG Heng，ZHONG Bo，ZHANG Shi-lin et al

（Technology Research Institute of Aquaculture Industry in Hubei Province，Jingzhou，Hubei 434020）

Abstract ［Objective］ To clarify the potential toxic effects of organic solvents on the test objects in the algal toxicology test.［Method］Chlorella vulgis was used as the research object to study the effects of three organic solvents （dimethyl sulphoxide，ethanol，and acetone） with different volume fractions on its growth rate，chlorophyll a content and other growth characteristics.［Result］When the volume fraction of DMSO was 0.01%-0.10%，the density of Chlorella vulgaris had no significant difference compared with the control group.When the volume fraction was 0.50%-5.00%，the growth of Chlorella vulgaris was significantly inhibited.When the concentration of ethanol and acetone was 0.01%-2.00%，the growth of Chlorella vulgaris was significantly promoted.When the concentration of ethanol and acetone was 5.00%，the inhibition effect of Chlorella vulgaris was obvious.The change trend of chlorophyll-a content of Chlorella vulgaris under the influence of three organic solvents was consistent with the density and growth rate of Chlorella vulgaris.［Conclusion］The experimental results were consistent with the law of low concentration promoting high concentration inhibition in ecotoxicology，and Chlorella vulgaris showed stronger sensitivity to ethanol and acetone.It is suggested that DMSO should be used as the organic solvent in the toxicological experiment of Chlorella vulgaris，and the maximum volume fraction （NOEC） should be 0.10%.

Key words Dimethyl sulfoxide;Ethanol;Acetone；Chlorella vulgaris；Algal density；Chlorophyll a

基金项目 荆州市科技计划重点项目（2021BA18）。

作者简介 张恒（1992—），男，江苏南通人，助理工程师，硕士，从事生态毒理学研究。通信作者，工程师，从事鱼类苗种繁育研究。

收稿日期 2022-02-28

有机溶剂是以有机物为介质，具有脂溶性和挥发性的有机化学物质［1］。在环境污染物的水生态风险评价试验中，尤其是暴露于疏水性典型环境有机污染物的毒性试验，有机溶剂的使用更为普遍［2］。有机溶剂也具有一定的毒性，如对皮肤的原发性刺激、对中枢神经系统的非特异性抑制以及对周围神经系统、肺和心脏的特异性作用等［3］，在有有机溶剂使用的毒理学试验中，对试验对象的毒性效应应该重视，因此毒理学试验中有机溶剂的种类选择及其浓度设置显得尤为重要。

浮游植物（主要是微藻）的多样性和生物量直接影响着水生生态系统的结构和功能，对水环境的平衡和稳定起着极其重要的作用［4］。大多数微藻体积小，繁殖快，适应性强，对有毒物质敏感。近年来，藻类作为水环境指示生物已被广泛应用于水安全评价和环境毒物检测中［5］。普通小球藻（Chlorella vulgaris）属绿藻门（Chorophyta）小球藻科（Chlorellaceae）小球藻属（Chlorella）［6］，分布广泛，可大量繁殖形成水华，也是多污染区和中等污染区的指示生物，是一种理想的化学物质毒性受试生物［7］。该研究以普通小球藻为研究对象，分别进行3种常见有机溶剂［二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、乙醇（ethanol）、丙酮（acetone）］对其的单一毒性效应，分析并比较对其生长特性的影响，为有机溶剂在藻类毒理学研究中的应用提供基础数据和参考方法。

1 材料与方法

1.1 溶剂 丙酮和乙醇购自天津市北联精细化学品开发有限公司，二甲基亚砜购自天津市科密欧化学试剂有限公司，这3种有机溶剂的基本性质如表1所示。

1.2 藻种及其培养 普通小球藻购自中国科学院水生生物研究所淡水藻种库。

采用BG11培养液培养，接种培养液高压灭菌，取处于对数生长期的藻种进行接种，接种藻密度为1.0×105～1.5×105 cells/mL（初始OD680为0.017～0.021）。培养条件：温度为25 ℃，光暗比为12 h∶12 h，光强为5 000 lx左右。丙酮、乙醇、二甲基亚砜体积分数分别为0.01%、0.05%、0.10%、0.50%、2.00%、5.00%，每组设3个重复，并设不加有机溶剂空白对照组（CK），藻液体积共300 mL，静置培养，每天定时人工摇瓶3～4次。

1.3 藻类生长效应的测定

每隔24 h使用紫外-可见光分光光度计，于680 nm处检测各处理组和对照组藻培养液的光密度，连续检测8 d。利用预先测定的藻细胞密度与光密度的标准曲线计算试验样本中藻细胞密度，公式如下：

Y=84.893 1X-0.336 1（R2=1）（1）

式中，Y为藻密度（×105cells/mL）；X为680 nm处的光密度。

1.4 比生长速率测定

比生长速率（specific growth rate，SGR）［8］按一般生物学计算公式计算，公式如下：

K=（lnN2-lnN1）/（t2-t1）（2）

式中，K为比生长速率（d-1）；N2为t2的藻密度（cells/mL）；N1为t1的藻密度（cells/mL）；t代表生长时间（d）。

1.5 叶绿素a含量的测定 取10 mL藻液借助抽滤装置通过0.45 μm醋酸纤维膜，真空泵压泵的压力维持在0.05 MPa，膜上多余水分抽干，将滤膜剪碎后放入加有10 mL 90%乙醇溶液的旋口刻度管中，75 ℃水浴锅中提取5 min，对其提取液进行测定，用分光光度计读取其665和750 nm处的光密度。再向提取液加入1～2滴l mol/L盐酸，酸化8 min后再次读取其665和750 nm处的光密度。根据公式（3）计算出原藻液中各叶绿素a的含量：

C（chl-a）=27.3（Ea-Eb）ve/v（3）

式中，C（chl-a）为叶绿素a含量（μg/L）；Ea为提取液酸化前波长665和750 nm处的光密度之差，Eb为提取液酸化后波长665和750 nm处的光密度之差，ve为乙醇提取液的体积（mL），v为抽滤的水样体积（L）［9］。

1.6 溶剂NOEC值的测定

利用藻类生长曲线，通过方差分析，与对照组没有显著差异的最高体积分数，可以认为是最大无影响体积分数（NOEC）。

1.7 数据处理 采用Origin 8.0进行数据的图表分析，采用SPSS 20.0软件进行相关性分析。试验数据以平均值±标准差（Mean±SD）表示。采用单因素方差分析（ANOVA）进行分析，事后检验采用Duncan方法或Dunnett’s C test对各试验组与对照组的数据进行比较。

2 结果与分析

2.1 3种有机溶剂对普通小球藻藻密度的影响

由图1可知，当二甲基亚砜体积分数为0.01%～0.10%时，普通小球藻藻密度与空白对照相比无显著差异；而在体积分数0.50%～5.00%时开始表现出对藻细胞具有抑制作用，抑制率最高达61.90%，二甲基亚砜对普通小球藻NOEC为0.10%。当丙酮和乙醇体积分数为0.01%～2.00%时，对藻细胞表现出较明显的促进作用，最大促进率分别为444.84%和480.55%；当体积分数均为5.00%时，对藻细胞抑制作用明显，抑制率分别为78.78%和74.67%，丙酮和乙醇对普通小球藻NOEC值均为0.01%，表现出低浓度促进高浓度抑制的作用。

由表2可知，当二甲基亚砜体积分数0.01%～0.10%时，藻密度和比生长速率均与对照组相比差异不显著（P>0.05），其中最高藻密度4.015×105 cells/mL对应的体积分数是0.05%，最高比生长速率（0.250 d-1）对应的体积分数是0.10%。乙醇和丙酮对藻密度和比生长速率的影响均呈先上升后下降的趋势，体积分数0.01%～2.00%与对照组相比增幅显著，体积分数5.00%时比生长速率有负值出现，呈负增长。

由表3可知，3种有机溶剂在体积分数较低时普通小球藻的生长状况符合二次方程的相关性。二甲基亚砜体积分数0.01%～0.10%时，方程系数a为正值，抛物线开口向上；丙酮、乙醇体积分数0.01%～2.00%时回归方程系数a均大于对照组，与藻密度变化趋势相同。当二甲基亚砜体积分数0.50%～5.00%，乙醇、丙酮体积分数5.00%时回归方程发生实质性改变，方程次数由二次增加为五次、六次。